曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)估丙泊酚麻醉效果

8只8周齡C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為兩組，即35mg/kg注射劑量組和50mg/kg注射劑量組。為模擬光纖手術(shù)需接受的麻醉暴露條件，將小鼠放入麻醉誘導(dǎo)箱(尺寸：20cm×20cm×15cm)中，給予1.5%異氟烷混合60%氧氣，持續(xù)2h，氣體流量為0.6L/h，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用動(dòng)物保溫毯維持體溫，4周后進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。將濃度為10mg/ml丙泊酚注射液用5%葡萄糖溶液稀釋成5mg/ml，稱量小鼠的體質(zhì)量，計(jì)算注射劑量進(jìn)行腹腔注射。注射完成后放入搭建好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)開(kāi)始視頻記錄，每只小鼠記錄10min。分析小鼠10min內(nèi)的活動(dòng)狀態(tài)(如翻正反射是否消失)及移動(dòng)距離和速度情況，評(píng)估丙泊酚麻醉效果。

光纖鈣信號(hào)記錄

在避光環(huán)境下，打開(kāi)光纖記錄系統(tǒng)，等待基線穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)前稱量小鼠體質(zhì)量計(jì)算腹腔注射劑量，將小鼠放入在透明實(shí)驗(yàn)箱中適應(yīng)10min后，記錄原始基線幅值后進(jìn)行光纖記錄，同時(shí)視頻記錄小鼠行為。清醒狀態(tài)下記錄小鼠5min后，腹腔注射0.9%NaCl注射液/丙泊酚溶液，觀察小鼠行為變化，標(biāo)記出現(xiàn)翻正反射消失(loss of righting re-flex，LORR)和翻正反射恢復(fù)時(shí)間，待恢復(fù)后再記錄5min，其中，翻正反射消失的定義標(biāo)準(zhǔn)為：調(diào)整小鼠姿態(tài)為仰臥位后在10s內(nèi)無(wú)法恢復(fù)立位。

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數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)使用攝像頭架設(shè)在實(shí)驗(yàn)箱一側(cè)，觀察小鼠肢體運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。通過(guò)行為學(xué)視頻分析將鈣信號(hào)采集過(guò)程中的事件點(diǎn)(如腹腔注射完成、反常興奮期、翻正反射消失及恢復(fù))記錄下來(lái)用于在鈣信號(hào)數(shù)據(jù)做時(shí)間標(biāo)記。將光纖記錄系統(tǒng)采集到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Matlab中，通過(guò)對(duì)小鼠行為視頻錄像的分析，截取從腹腔注射完成到翻正反射恢復(fù)一段的熒光信號(hào)，并以出現(xiàn)“反常興奮”的時(shí)刻點(diǎn)為零點(diǎn)，對(duì)上述時(shí)間窗內(nèi)腹腔注射丙泊酚麻醉誘導(dǎo)的SNr熒光強(qiáng)度變化進(jìn)行分析。將小鼠在清醒自由活動(dòng)狀態(tài)下的熒光信號(hào)強(qiáng)度作為基線熒光強(qiáng)度f(wàn)0，時(shí)間窗內(nèi)每時(shí)刻的熒光強(qiáng)度作為f，通過(guò)計(jì)算當(dāng)前熒光信號(hào)強(qiáng)度和基線熒光強(qiáng)度的差值再除以基線熒光強(qiáng)度，即△f/f=(f－f0)/f0得到熒光強(qiáng)度變化。

35mg/kg組小鼠在腹腔注射丙泊酚約30s會(huì)出現(xiàn)行為活躍性增加的現(xiàn)象，具體表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)速度增加、左搖右晃步態(tài)且伴有頻繁的前/后肢的搔抓。該組小鼠都未出現(xiàn)翻正反射消失，并在6～7min左右步態(tài)恢復(fù)。50mg/kg組小鼠同樣在30s左右出現(xiàn)了活躍性增加的現(xiàn)象，但與35mg/kg組小組比較，小鼠的移動(dòng)距離和速度降低，在4min左右出現(xiàn)了翻正反射消失，持續(xù)約90s。

光纖鈣信號(hào)記錄：對(duì)自由活動(dòng)小鼠的黑質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的GABA能神經(jīng)元進(jìn)行光纖記錄，發(fā)現(xiàn)在清醒狀態(tài)下神經(jīng)元呈非同步、運(yùn)動(dòng)相關(guān)發(fā)放。在行動(dòng)時(shí)，鈣活動(dòng)水平低，而在靜止不動(dòng)時(shí)神經(jīng)元發(fā)放幅值大，而在麻醉狀態(tài)下神經(jīng)元?jiǎng)t以一定節(jié)律同步發(fā)放，且幅值減弱。腹腔注射0.9%NaCl注射液并沒(méi)有引起SNr神經(jīng)元鈣活動(dòng)的改變，而給予丙泊酚50mg/kg劑量注射后，GABA能神經(jīng)元的活動(dòng)隨小鼠的狀態(tài)發(fā)生了明顯的改變。腹腔注射完成1min后，小鼠出現(xiàn)反常興奮，伴隨每一次搔抓前肢，鈣信號(hào)幅值增大。隨著鎮(zhèn)靜水平的加深，小鼠的活動(dòng)減弱至翻正反射消失，待蘇醒后，前期小鼠的活動(dòng)少，記錄到的神經(jīng)元鈣信號(hào)增加。

實(shí)驗(yàn)裝置

A．曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn);B．病毒注射及光纖植入的模式圖;C．光纖記錄系統(tǒng)模式圖

自由活動(dòng)小鼠的光纖鈣信號(hào)記錄結(jié)果

A．清醒狀態(tài)下;B．麻醉狀態(tài)下

對(duì)小鼠進(jìn)行丙泊酚麻醉誘導(dǎo)，鈣活動(dòng)水平會(huì)隨著“反常興奮”期的出現(xiàn)而增強(qiáng)，而當(dāng)翻正反射消失后，鈣活動(dòng)減弱。腹腔注射丙泊酚引起的麻醉時(shí)效短，與丙泊酚藥物代謝快相關(guān)，也可能與小鼠經(jīng)過(guò)多次麻醉后出現(xiàn)了耐受有關(guān)。在麻醉恢復(fù)后，小鼠會(huì)出現(xiàn)嗜睡現(xiàn)象，SNr的神經(jīng)元鈣活動(dòng)也相應(yīng)增強(qiáng)。