流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的對(duì)象一般是呈獨(dú)立狀態(tài)的懸浮于液體中的細(xì)胞，如果要檢測(cè)組織中的細(xì)胞，則必須先將組織制備成單細(xì)胞懸液，而后方可進(jìn)行檢測(cè)。

制備基本流程如下：

1.細(xì)胞的培養(yǎng)、制備

將一定數(shù)量的單個(gè)細(xì)胞收集于1.5mL的EP管中，2400rpm、4℃離心4min，棄上清；加入1xPBS清洗，同等條件進(jìn)行離心，棄上清。

2.封閉

用來標(biāo)記樣品細(xì)胞的熒光素偶聯(lián)抗體多為單克隆抗體，少數(shù)也可能是多克隆抗體，但其基本結(jié)構(gòu)都是由兩部分組成：包含有特異性結(jié)合抗原位點(diǎn)的Fab段、相對(duì)保守的Fc段?？贵w的特異性表現(xiàn)在Fab段，標(biāo)記時(shí)利用Fab段的抗原結(jié)合位點(diǎn)與細(xì)胞上抗原分子進(jìn)行特異性結(jié)合，從而進(jìn)行標(biāo)記并且相對(duì)量化的展示了細(xì)胞表達(dá)該抗原分子的情況。

3.熒光素偶聯(lián)抗體標(biāo)記

以CD3-APC-Cy7、CD4-FITC為例，一般染色體系推薦100μl，CD3、CD4表達(dá)量相對(duì)較高，1μl足夠了，假如有9個(gè)樣本，分別取10μlCD3-APC-cy7、CD4-FITC加到含有990μl的1.5ml的EP管中，混勻后，分別取100μl加到9個(gè)樣品孔中，混勻，室溫、避光染色20min。時(shí)間到后加1ml FACS buffer洗去未結(jié)合的抗體，2400rpm、4°C離心4min，棄上清，加200μl FACS buffer或2%的多聚甲醛重懸沉淀，并盡快上機(jī)分析。

4.光電倍增管電壓的設(shè)定

上機(jī)分析時(shí)，在確認(rèn)機(jī)器沒有問題后，需調(diào)節(jié)每個(gè)通道的光電倍增管的電壓，從而區(qū)分細(xì)胞群，利用FSC和SSC，通過調(diào)節(jié)FSC和SSC的電壓，區(qū)分淋巴細(xì)胞亞群，使樣品細(xì)胞或者目標(biāo)細(xì)胞位于流式圖的中央或者靠近中央的位置。FSC和SSC的電壓確定之后還需調(diào)節(jié)APC-cy7、FITC的電壓，使陽性細(xì)胞群和陰性細(xì)胞群盡可能的分離。

5.設(shè)置對(duì)照，補(bǔ)償調(diào)節(jié)

流式實(shí)驗(yàn)中對(duì)照設(shè)置很重要，常見的有陰性對(duì)照、FMO對(duì)照、補(bǔ)償單陽管對(duì)照。