流式細胞術工作原理是在細胞分子水平上通過單克隆抗體對單個細胞或其他生物粒子進行多參數(shù)、快速的定量分析。它可以高速分析上萬個細胞，并能同時從一個細胞中測得多個參數(shù)，具有速度快、精度高、準確性好的優(yōu)點，是當代最先進的細胞定量分析技術之一。

1.其測定細胞內(nèi)DNA的變異系數(shù)最小，一般在2%以下；

2.能準確地進行DNA倍體分析；

3.借助于熒光染料進行細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸的定量研究；

4.快速進行細胞分選和細胞收集；

5.醫(yī)學應用：免疫功能研究各種干細胞的檢測，癌癥病人的多藥耐藥性，細胞功能及代謝動力學研究，血小板分析（心血管疾病），流式細胞術與分子生物學研究；

6 應用于外周血內(nèi)皮細胞測定、調(diào)節(jié)性T細胞等尖端領域。

流式細胞儀（FCM）結構一般分為5部分：

流動室及液流驅動系統(tǒng)；

激光光源及光束成形系統(tǒng)；

光學系統(tǒng)；

信號檢測、存貯、顯示、分析系統(tǒng)；

細胞分選系統(tǒng)。

流動室（Flow chamber）是儀器核心部件，被測樣品在此與激光相交。

流動室充滿鞘液，樣品流在鞘液的環(huán)包下形成流體力學聚焦，保證每個細胞通過激光照射區(qū)的時間相等。

圖：FCM的流動室和液流系統(tǒng)

目前臺式機FCM，大多采用氬離子氣體激光器。激光是一種相干光源，提供單波長、高強度、穩(wěn)定性高的光照，是細胞微弱熒光快速分析的理想光源。

激光光束在達到流動室前，先經(jīng)過透鏡聚焦，形成稍大于細胞直徑的光斑。

FCM的光學系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片、小孔組成，它們分別將不同波長的熒光信號送入到不同的電子探測器。

在FCM的光學系統(tǒng)中主要光學原件是濾光片（Filter），主要分成3類：長通濾片（long-pass filter，LP）、短通濾片（short-pass filter，SP）及帶通濾片（band-pass filter，BP）。   

長通濾片：長通濾片使特定波長以上的光通過，特定波長以下的不通過。如LP500濾片，將允許500um以上的光通過，而500um以下的光吸收或返回。

短通濾片：與長通濾片相反，特定波長以下的光通過，特定波長以上的光吸收或返回。如SP500濾片，將允許500um以下的光通過，而500um以上的光吸收或返回。

帶通濾片：帶通濾片可允許相當窄的一波長范圍內(nèi)光通過，一般濾片上有兩個數(shù)，一個為允許通過波長的中心值，另一為允許通過光的波段范圍。如BP500/25表示其允許通過波長范圍為475um-525um。

散射光信號：散射光分為前向角散射（forward scatter，F(xiàn)SC）和側向角散射（side scatter，SSC），散射光不依賴任何細胞樣品的制備技術（如染色），因此被稱為細胞的物理參數(shù)或稱固有參數(shù)。

1）前向角散射：前向角散射與被測細胞的大小有關，確切說與細胞直徑的平方密切相關，通常在FCM應用中，選取FSC作閾值，來排除樣品中的各種碎片及鞘液中的小顆粒，以避免對被測細胞的干擾。

2）側向角散射：側向角散射是指與激光束正交90?方向的散射光信號，側向散射光對細胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，可提供有關細胞內(nèi)精細結構和顆粒性質(zhì)的信息。

以上兩種信號都是來自激光的原光束，其波長與激光的波長相同，目前采用這兩個參數(shù)組合，可區(qū)分裂解紅細胞處理后外周血白細胞中淋巴細胞、單核細胞和中性粒細胞三個細胞群體，或在未進行裂解紅細胞處理的全血樣品中找出血小板和紅細胞等細胞群體。

熒光信號：當激光光束與細胞正交時，一般會產(chǎn)生兩種熒光信號。一種是細胞自身在激光照射下，發(fā)出微弱熒光信號，稱為細胞自發(fā)熒光；另一種是經(jīng)過特殊熒光素標記細胞后，受激發(fā)照射得到的熒光信號，通過對這類熒光信號的檢測和定量分析，就能了解所研究細胞參數(shù)的存在與定量。

激光作用原理

數(shù)據(jù)的顯示通常有一維直方圖、二維點圖、等高線圖、密度圖等幾種。

圖：肺癌細胞DNA含量的Modifit LT分析直方圖

（橫坐標——DNA含量；縱坐標——細胞數(shù)量）

圖：肺癌細胞DNA含量的CellQuest分析直方圖

（橫坐標——FL2-A：細胞面積；縱坐標——細胞數(shù)）

圖：肺癌細胞DNA含量的假三維圖

圖：肺癌細胞DNA含量的二維散點圖

FL2-W——細胞寬度；FL2-H——細胞面積

圖：肺癌細胞DNA含量的等高線圖

FL2-W——細胞寬度；FFL2-A——細胞面積

流式儀通過內(nèi)置激光器激發(fā)熒光染料，將488nm或633nm的光轉變?yōu)榱硪徊ㄩL的光，并通過光電倍增管將光信號轉變?yōu)殡娦盘?，由計算機統(tǒng)計處理變?yōu)榭勺x數(shù)據(jù)。

事實上，各熒光素的發(fā)射波長呈正態(tài)或偏態(tài)分布，如圖。若同時使用兩種熒光染料，就會出現(xiàn)發(fā)射光譜相互疊加的現(xiàn)象。

圖：受激光照射后FITC和PE分子發(fā)射光譜互相干擾圖

FITC無PE熒光檢測補償調(diào)節(jié)示意圖

PE無FITC熒光檢測補償調(diào)節(jié)示意圖

A：陰性對照管（IgG-FITC/IgG-PE）

通過調(diào)節(jié)電壓，使陰性群體落在FITC及PE雙陰性區(qū)。

陰性對照實際為沒有特異性的、與抗體蛋白亞型一致的動物免疫球蛋白。由于化學鍵、生物鍵及分子之間的吸引作用，這些蛋白會與標本中的細胞結合，在流式細胞儀上可檢出一定的信號。

當熒光特異性抗體與標本結合時，會產(chǎn)生兩部分信號：非特異信號（即同陰性對照的信號）和特異性結合信號。所以我們只認為大于陰性對照的信號才是由特異結合而引起的信號并將其歸入統(tǒng)計范圍。

圖：PE和FITC分子的陰性對照

B：FITC標記抗體/IgG-PE）

在理想情況下（沒有熒光干擾），因為檢測管中只含有PE標記的IgG陰性對照，所以仍將沒有任何信號出現(xiàn)。但實際上，在PE坐標上出現(xiàn)了陽性信號。這個信號就是由于FITC熒光漏入PE探測器中而引起的。此時就要取一合適百分比的FITC信號相乘后去抵消PE中的信號。（此時電壓已通過陰性對照設定，絕對不可變動?。?/span>

未調(diào)節(jié)補償?shù)碾p參數(shù)直方圖

當將FITC漏入PE的信號恰好全部減除時，即PE信號與原本本底相同時，此時的補償便是正確的，即FITC單陽性細胞的PE的平均熒光強度與雙陰性細胞PE熒光強度一致。

由上圖可知，調(diào)節(jié)熒光補償首先要知道雙陰性細胞的情況，即通過A管調(diào)節(jié)電壓確定陰性范圍。其次，在檢測FITC標記管中，必須存在陽性細胞和陰性細胞；只有這樣才能有本底參照將PE的信號降至與本底一致而不會過多或過少的調(diào)節(jié)補償。

圖：FITC熒光信號補償?shù)恼{(diào)節(jié)

流式細胞術數(shù)據(jù)分析目的就是需要確定所要研究的目的細胞器,這就涉及到設門。設門就是劃定某一區(qū)域的細胞群體,對其單獨加以分析或分選。門的形狀可任意,方法有：

(1)閾值設門。FSC(前向散射光)是最常用的閾值參數(shù)。FSC 和細胞的大小正相關。用FSC 設閾值,可以使低于該閾值的細胞碎片等其他雜質(zhì)的信號不被處理。

(2)散射光設門。以FSC 和SSC(側向散射光)聯(lián)合設門較常用。其最大優(yōu)點是可以排除碎片或噪聲的?？梢愿鶕?jù)FSC vs SSC 散點圖上不同細胞分布不同來設門目的細胞群。

注意事項

設門是一種主觀行為，所以要盡可能客觀。需要考慮以下因素：

1、排除細胞碎片（建立一個FSC vs SSC點圖，確定所有分析細胞群在點圖可視范圍內(nèi)，細胞碎片、氣泡和激光背景噪的感染設在FSC-low的區(qū)域，在SC vs SSC中圈出感興趣的細胞群的周圍區(qū)域R1，這個區(qū)域可以被稱為R1-FSC vs SSC）

2、應用合適的熒光陰性對照（對照組用熒光同型抗體感染靶細胞，以區(qū)分陽性信號和陰性熒光背景。）

3、排除死細胞（用PI或者7-ADD標記活細胞，然后圈出活細胞區(qū)域）

4、如果合適，使用一種共享標記物

5、設置必需的熒光分析點圖

淋巴細胞分型—— 雙色法檢測外周血T、B、NK細胞試劑組合

淋巴細胞分型—— CD14/CD45設“門”確定淋巴細胞

T、B和NK細胞百分比總和應等于100%的淋巴細胞，但在實際中由于在FSC vs SSC中淋巴細胞設“門”中，會混入細胞碎片、單核及粒細胞，所以很難達到100%的比例。

如運用CD14/CD45設門來確定淋巴細胞“門”，則CD3細胞百分比 + CD19細胞百分比 + CD3-/(CD16+56)+細胞百分比應等于CD14/CD45中淋巴細胞百分比±5%，最大不得超過±10%。

淋巴細胞分型——CD3/CD19區(qū)分T、B淋巴細胞

CD3是T細胞特異性抗原，CD19則可用來識別B細胞。若用CD3/CD19雙標試劑，沒有雙陽性細胞群體存在，CD3、CD19表達為獨立的單陽性細胞群體。這樣就可不用同型對照來設定陰性或陽性界限。

CD3/CD19不僅可用來設定標本的陰性和陽性界限，它還可用來檢查儀器的補償設置和非特異性結合。應用該組合檢測時，會出現(xiàn)3群彼此獨立的細胞群，如細胞分群不清或位置發(fā)生偏差則要對樣本進行仔細分析。

用熒光標記雙參數(shù)檢測外周血成熟T細胞（CD3+/CD19-細胞為80.65%）

淋巴細胞分型—— CD3/CD4鑒定CD4+ T淋巴細胞

首先用CD3來區(qū)分全部T細胞。CD3/CD4雙陽性的為真正的Th細胞。這些細胞主要是HIV病毒感染對象。

CD3-/CD4+細胞群體是由單核細胞組成的。這些細胞相對于CD4+T細胞來說弱表達，在光散射參數(shù)的位置分布也較廣。CD3/CD4抗體組合能完全將CD4+T細胞與CD4+的單核細胞區(qū)分開來。

此管也可檢測補償及非特異性結合情況。CD3+/CD4-細胞群體應明顯地與CD3/CD19中CD3+細胞群位置相重合。

用熒光標記雙參數(shù)檢測外周血輔助T細胞（CD3+/CD4+細胞為4.65%）

淋巴細胞分型—— CD3/CD8鑒定CD8+ T淋巴細胞

同時表達CD3/CD8的細胞群才是真正的CD8+T淋巴細胞，CD8的表達包括弱陽性和強陽性部分。CD3-/CD8+細胞包括一部分NK細胞和少數(shù)粒細胞。這些細胞弱表達CD8+，由于缺少CD3，易于從CD3+/CD8+T淋巴細胞相區(qū)別。

雙標試劑可用來檢查補償設置和非特異性結合情況。雙陰性細胞可視作內(nèi)部的陰性對照。CD3陽性群體應與CD3/CD19、CD3/CD4中的CD3陽性群體處于同一位置。

用熒光標記雙參數(shù)檢測外周血抑制T細胞（CD3+/CD8+細胞為19.00%）

淋巴細胞分型—— NK細胞

CD16（FcRⅢ）表達于大多數(shù)NK細胞上，但也表達于中性粒細胞上，這種抗原在NK細胞的表達比較弱并在NK細胞活化時丟失。

CD56表達于大多數(shù)的（但并不是全部）NK細胞上，也表達于一些T淋巴細胞上。與CD3聯(lián)合使用，可以區(qū)分CD3+/CD56+T淋巴細胞和CD3-/CD56+NK細胞。

聯(lián)合使用三種單抗能最完全的鑒定所有的NK細胞。NK細胞或表達CD16，或表達CD56，但它們不表達CD3。CD16和CD56聯(lián)合使用，根據(jù)熒光強度可將NK細胞從雙陰性細胞中區(qū)分出來。這樣運用該組試劑，NK細胞可形成獨立的群體與其它細胞相區(qū)分。

圖：用熒光標記雙參數(shù)檢測外周血NK細胞（CD3-/CD(16+56)+細胞為14.43%）