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1.冰凍切片蘇木素伊紅染色 1 將4%多聚甲醛灌注后的大腦，用冰凍切片機切片，厚度為10~40微米。 2 將腦片貼在載玻片上，并且吹干過夜。 3 將腦片脫脂（若是腦組織直接冰凍，則不需要脫脂）： （a）將腦片浸沒在氯仿和100%乙醇混合物中至少1小時。 （b）將腦片分別在100%、95%、70%和50%的乙醇中各浸泡5分鐘，然后用蒸餾水沖洗。 注意：必須等到片子完全干燥（沒有水滴）。如果腦片是幾天前準備的，在染色之前必須放到蒸餾水中浸泡5分鐘。 4 染色步驟： （a）將蘇木素滴在腦片上，染色20~25分鐘。整個過程用眼睛或顯微鏡觀察，保證細胞核變藍。 （b）用蒸餾水洗2次。 （c）用0.25%的氨水溶液輕輕沖洗約10秒。 （d）用蒸餾水洗2次。 （e）用伊紅染色10秒 （f）用蒸餾水洗2次。 （g）用70%、80%、90%、95%、100%的乙醇脫水1次，每次3分鐘。 （h）用100%乙醇與二甲苯混合液脫水3分鐘。 （i）用二甲苯處理5分鐘 （j）滴2~3滴封片劑，用蓋玻片封住腦片，準備在顯微鏡下觀察。 2.石蠟切片的蘇木素-伊紅染色 1 修剪組織：如果大腦固定在4%6的多聚甲醛里，那么修剪組織必須在通風櫥里進行。去除小腦和嗅球部分。大腦用水沖洗干凈，冠狀切片切成3份。組織放在生理鹽水中。 2 處理以及石蠟包埋：在自動包埋機上進行包埋。金屬盒放在機器中過夜。組織進行梯度脫水，并用石蠟進行包埋。 3 組織包埋的步驟: （a）加熱溫度控制在59~61℃； （b）樣品控制臺溫度在59~61℃； （c）冷凍臺溫度為5℃； （d）組織轉移到加熱臺上，浸在石蠟中，然后移至樣品控制臺。 注意：不要把樣品放反了，同時要保持它們的方向一致。把鐵塊放在冷凍臺上，冷卻20分鐘。 4 室溫下在切片機上切片： （a）水浴溫度控制在45~50℃。 （b）石蠟組織放在冰水混合物中。 （c）室溫下設置好切片機。 （d）45℃，吹干載玻片20分鐘。 （e）蠟塊固定在切片機上，修整蠟塊表面，直至大腦組織出現(xiàn)。 （f）切片，厚度可根據試驗要求，切成4~10微米。 （g）腦片轉移到水浴中，然后貼在載玻片上。 5 預染：載玻片在60℃的烘箱中烤片15分鐘，融化石蠟，使乙醇揮發(fā)。注意用架子架住載玻片。 6 HE染色：可以自動也可以手動進行。 1）自動：染色在染色機中進行，依次用以下溶液處理： （a）3次二甲苯； （b）2次100%乙醇； （c）2次95%乙醇； （d）蘇木素染色； （e）2次95%乙醇； （1）70%乙醇； （g）伊紅染色； （h）70%乙醇； （i）3次二甲苯。 2）手動：每一步驟約1~2分鐘，整個過程需要25~30分鐘。載玻片放入盒子中，滴2~3滴封片劑，然后用蓋玻片小心地蓋在上面。 ① 注意事項： （a）封片前片子不要干燥，封片劑將永久地封住腦片； （b）在完全干燥之前保證片子平整； （c）在顯微鏡下觀察片子的染色效果。例如：如果組織在冰盒中的浸泡時間不足夠長，組織看起來會有皺褶。如果漂片溫度太高，片子會碎，如果溫度太低，片子不能漂浮。 ② 手動的HE染色方法： （a）3次二甲苯，每次2分鐘，脫去脂肪和蠟； （b）100%乙醇，每片10滴； （c）95%乙醇，2次，每片10滴； （d）蒸餾水洗； （e）蘇木素染色15分鐘； （f）蒸餾水洗2次； （g）0.25%氨水洗，直至組織變藍； （h）蒸餾水洗2次； （i）0.5%的伊紅染色，每片10~20滴； （j）95%乙醇，洗2次，每片10~15滴； （k）100%乙醇，每片10滴； （l）3次二甲苯，每片10滴。 蘇木素伊紅染色后細胞核呈藍色，細胞質呈粉紅色或紅色。如下圖所示：  |
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