今天小編為各位解析題為“Extensive translation of circular RNAs driven by N⁶-methyladenosine”的文章，通訊作者為中科院上海計算生物學研究所王澤峰教授。文章報道了，人細胞中的m6A修飾——這一RNA中豐度最高的堿基修飾，能有效地起始circRNA的蛋白翻譯。作者發(fā)現(xiàn)，circRNA上有公認的m6A motif富集，而一個m6A位點就足夠啟動翻譯的起始。這個m6A啟動的翻譯需要起始因子eIF4G2和m6A識別蛋白YTHDF3，同時能被甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3/14加強，能被去甲基化酶FTO抑制，也能被熱激上調(diào)。通過polysome profiling、電腦預測以及質(zhì)譜實驗發(fā)現(xiàn)，m6A驅(qū)動的circRNA翻譯是廣泛存在的，有數(shù)百個內(nèi)源的circRNA都有翻譯潛能。作者的研究，拓寬了人類轉(zhuǎn)錄組的研究，同時也提示了一種circRNA來源的蛋白在應對環(huán)境壓力中的角色。

Introduction

目前關于circRNA的研究，主要報道其能作為誘餌吸附miRNA(比如miRNA海綿)或結(jié)合和隔離一些RNA結(jié)合蛋白，然而大部分的circRNA的生物學功能仍然未知。一個很有趣的可能是，circRNA能翻譯蛋白，因為絕大部分的circRNA是由外顯子構(gòu)成的，且circRNA主要分布在細胞質(zhì)中。事實上，含有內(nèi)部核糖體進入位點（internal ribosomal entry site, IRES）的人工circRNA在體外或體內(nèi)都可以翻譯。然而circRNA的編碼潛能仍然是個開放的問題，因為很早前的報道中提到，絕大部分的circRNA與多核糖體沒有什么關聯(lián)。

m6A是真核生物中豐度最高的RNA修飾。這個修飾偏向于發(fā)生在一個公認的motif基序“RRm6ACH”(R=G或A；H=A, C或U)，通過MeRIP Seq，共在人和小鼠中發(fā)現(xiàn)了超過7000個mRNA和300個非編碼RNA有m6A修飾。腺嘌呤（A）的甲基化是由METTL3\METTL14和Wilms’腫瘤1相關蛋白構(gòu)成的甲基轉(zhuǎn)移酶復合體催化形成。m6A的去甲基化可由FTO(fat mass and obesity-associated protein)和AKLBH5(alkylated DNA repair protein alkB homolog 5)催化。細胞中，m6A能被YTH結(jié)構(gòu)域家族蛋白YTHDF1,2和3識別和結(jié)合，他們即是m6A的識別蛋白。m6A修飾能影響多個階段的RNA代謝，包括mRNA定位、剪接、翻譯和降解，反過來調(diào)控重要的生物學過程比如干細胞分化。特別地，m6A對翻譯有多方面的影響：3‘ UTR上的m6A能通過被YTHDF1結(jié)合后，能提高翻譯效率，然而5‘ UTR上的m6A通過YTHDF2蛋白機制促進熱激作用下的帽子非依賴翻譯。此外，近期有報道稱YTHDF3通過與YTHDF1協(xié)同作用促進蛋白合成，而胞質(zhì)中的YTHDF3與核糖體蛋白相互作用促進mRNA翻譯也進一步支持前面的發(fā)現(xiàn)。然而，m6A對mRNA翻譯的一般作用仍然是個不完整的故事，細節(jié)的機制仍然未知。

本文報道人細胞中的circRNA通過一段含有m6A位點的短序列作為IRES而有限地翻譯。FTO能減少circRNA的翻譯，甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3/14能促進翻譯，同時需要真核生物翻譯起始因子eIF4G2和m6A識別蛋白YTHDF3。

Results

• 有m6A motif的circRNA能在細胞內(nèi)翻譯

早前，作者構(gòu)建了一個minigene報告基因，包含有split GFP來證明用病毒IRES 能啟動circRNA的翻譯（下圖A）。作者插入了人基因組中幾種內(nèi)源IRES或?qū)φ招蛄械腸ircRNA，檢測是否也能翻譯。令人驚訝的是，所有插入序列，包括3個38-253nt的陰性對照，都能有效地起始GFP翻譯（下圖B）。

讓作者很疑惑的是為什么插入陰性對照也能誘導circRNA翻譯，作者研究了翻譯起始位點附近的序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有的陰性對照都在起始密碼子附近含有一個RRACH motif，使其帶上m6A修飾（下圖左）。因為m6A被報道能提高mRNA翻譯的效率，作者猜測含有m6A的RRACH序列或許參與了circRNA翻譯的起始。為了驗證這個假設，作者在circRNA報道基因起始密碼子的前面插入了一小段含有不同拷貝數(shù)的m6A motif序列，同時檢測在轉(zhuǎn)染的293細胞中GFP蛋白的產(chǎn)量。與預期相符，含有1個或2個m6A motif的circRNA就能有限地翻譯出GFP蛋白，而含有突變motif的細胞中，產(chǎn)量則顯著減少（下圖右）。此外，含2個m6A motif序列的circRNA與含1個motif序列的circRNA相比，其翻譯效率相似，說明獨立的一個m6A位點就足夠起始翻譯了。當插入任何不含腺嘌呤（A）的序列后，circRNA的翻譯都消失。除此之外，作者試驗了兩個被報道能發(fā)生m6A修飾的序列，RSV和RSVns，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩個序列也能強烈地誘導circRNA翻譯。重要地是，降低m6A甲基化的序列同時能降低翻譯效率，也更加證明了m6A驅(qū)動了circRNA的翻譯。

作者在Hela細胞中的研究也發(fā)現(xiàn)了circRNA的翻譯，這意味著m6A起始的circRNA翻譯是不受細胞類型限制。但是，在Hela細胞中，即使是突變的m6A motif，也仍然有一些GFP蛋白的表達。這或許是因為m6A發(fā)生在了非經(jīng)典的位點或者是在Hela細胞中其他一些序列可以起始m6A依賴的circRNA翻譯。

• 調(diào)控circRNA的m6A水平影響翻譯效率

為了進一步研究m6A對于circRNA翻譯的重要作用，作者通過RNA-IP檢測含有m6A motif的circRNA是否真的被甲基化了。結(jié)果顯示，識別m6A位點的抗體特異性地富集到了含有RSV m6A位點的circRNA以及一個已知的含有m6A修飾的mRNA(SON mRNA)，沒有富集到未含有m6A的對照mRNA。含有突變m6A位點的circRNA（RSV-mut）也同樣被富集到了，但含量非常低。這個研究表明，突變能降低RSV上的m6A修飾但不能完全去除該修飾，這與插入RSV-mut 報告基因的circRNA中有少量GFP表達的結(jié)果一致。亦或者，在circRNA中還有其他小的m6A位點。此外，共表達m6A去甲基化酶FTO能顯著減少免疫沉淀的SON mRNA或含有RSV的circRNA的富集水平，也能降低從circRNA上翻譯GFP（下圖A&B），進一步確認circRNA/mRNA的m6A位點的確發(fā)生了甲基化，同時circRNA的翻譯的確是m6A起始的。與這些發(fā)現(xiàn)一致的是，共表達甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3/14能顯著增加含有m6A位點的circRNA或mRNA的RNA RIP信號，且能顯著增加circRNA的蛋白翻譯（下圖C&D）。

m6A甲基化在熱擊壓力下會影響mRNA的翻譯。參考了這個思路，作者在42℃ 1h處理后又恢復到37℃的細胞中發(fā)現(xiàn)了含有m6A的circRNA翻譯的蛋白量上升，而GFP circRNA的水平并未發(fā)生變化（下圖）。這個發(fā)現(xiàn)表明，m6A介導的蛋白翻譯，尤其是從circRNA的翻譯，或許是細胞應激反應的一個重要參與者。一個可能的機制是，在熱擊作用下胞質(zhì)中的YTHDF2轉(zhuǎn)位至細胞核內(nèi)，封閉了m6A去甲基化酶FTO，增加了circRNA上的m6A修飾水平，進而增強了circRNA的翻譯。亦或者，熱擊壓力廣泛地減少了帽子依賴的翻譯，引起細胞都轉(zhuǎn)向了通過IRES的非帽子依賴的翻譯，因此circRNA非帽子依賴的翻譯也就相應增加了。

• m6A起始的circRNA翻譯需要蛋白因子的參與

circRNA翻譯需要通過一種和線性RNA翻譯完全不一樣的機制。真核生物的翻譯是eIF4復合體起始的，eIF4E與mRNA的帽子結(jié)合，同時eIF4G作為蛋白結(jié)合支架組裝起始復合體。緊接著，激活的40S 核糖體亞基在eIF3結(jié)合eIFG4后被招募至mRNA處（下圖A左）。在帽子非依賴的翻譯中，在eIF4E不存在的情況下，一個非典型的eIF4G蛋白（eIF4G2）直接識別一個IRES并起始eIF4復合體組件，引起翻譯的起始（下圖A右）。為了深入理解m6A驅(qū)動的circRNA翻譯，作者研究了circRNA翻譯起始中eIF4G2的參與。用兩個穩(wěn)定的表達有eIF4G2 shRNAs的細胞株（下圖B），作者檢測了circRNA或者mRNA編碼的GFP的表達。與預期相符，eIF4G2缺失顯著降低了circRNA的蛋白翻譯，但是并未影響線性mRNA的翻譯（下圖C）。相似地，eIF2A，一個eIF3的亞基與病毒IRES結(jié)合，適宜地降低了circRNA的翻譯，但是并未影響線性mRNA的翻譯（下圖D&E）。最后綜合各種結(jié)果，作者得出結(jié)論，circRNA的翻譯是通過一個依賴于eIF4G2的機制。

接下來，作者研究了含有m6A的circRNA的翻譯是否需要m6A識別蛋白。作者發(fā)現(xiàn)，RNAi處理后的YTFDF1的缺失不會影響circRNA的翻譯，而YTHDF2的缺失會輕微地抑制線性RNA和circRNA的GFP翻譯。然而，YTHDF3的缺失則顯著抑制了circRNA的GFP翻譯，但不影響線性RNA的翻譯，這提示說YTHDF3對于m6A驅(qū)動的circRNA翻譯是必須的。與此一致的是，免疫共沉淀結(jié)果顯示，YTHDF3能直接與eIF4G2相互作用，提示YTHDF3可能在招募eIF4G2至含有m6A的RNA中扮演一定的角色。

此外，作者通過基因組分析多種起始因子的結(jié)合位點、,轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的m6A檢測、翻譯起始位點（TIS）比對等方法來研究體內(nèi)circRNA分子的可能翻譯情況。研究表明，eIF4G2和eIF3A傾向于結(jié)合在有m6A和TIS的circRNA，這與前面發(fā)現(xiàn)這些因子可以促進circRNA翻譯相一致。與預期一致，eIF4G2的結(jié)合位點經(jīng)常與預測到的TIS附件的m6A修飾相重合（下圖）。

• 鑒定內(nèi)源的含有m6A修飾的circRNA

通過m6A IP結(jié)合高通量測序的方法，作者共鑒定到85個含有m6A修飾的circRNA。根據(jù)m6A IP vs 總input中circRNA reads的分布，作者預測13%的circRNA有m6A修飾。鑒于作者的實驗設計和分析過于嚴格，這個數(shù)據(jù)或許是個保守的估計，因為作者的實驗只有一部分含有m6A位點的被IP富集到，且只有back-splice junction附近的m6A位點才被認為是circRNA reads。盡管如此，這些數(shù)據(jù)仍能說明，circRNA存在著大量的m6A甲基化修飾。

• 人轉(zhuǎn)錄組中普遍存在著有編碼潛能的circRNA

根據(jù)以上的研究，作者開發(fā)了一個流程，通過一系列過濾設置，預測內(nèi)源性的有翻譯潛能的circRNA。以從Hs68細胞的RNase R處理后的RNA seq中得到的7771個circRNA作為起始，作者首先鑒定了623含有m6A peak的circRNA，又進一步通過pre-mapped TIS的過濾設置，將候選者縮小至124個circRNA。最后挑選了25個有足夠長ORF（≥150nt或編碼超過50個aa的蛋白）的circRNA。進一步通過多核糖體檢測把從25個circRNA中挑選的12個進行試驗驗證，發(fā)現(xiàn)其中有10個的確與多核糖體相關。作者認為這些通過嚴格過濾的25個circRNA只代表了培養(yǎng)細胞中有翻譯潛能的circRNA的一小部分。深入地研究還會增加有翻譯潛能circRNA檢測的靈敏度。

作者又通過實驗去尋找人轉(zhuǎn)錄組中正在進行活躍翻譯的circRNA。作者首先用蔗糖梯度離心的方法純化多核糖體相關的RNAs，緊接著用RNase R處理純化得到的RNA，然后進行高通量測序。測序reads比對到人基因祖上，用CIRCexplorer鑒定back-splice junction。作者發(fā)現(xiàn)有250個circRNA與多核糖體有作用。前面預測到的25個circRNA中，只有一個在polysome profiling/circRNA中找到。提示作者的方法，并沒有飽和。

作者進一步用RT-PCR研究了單核糖體和多核糖體相關的circRNA，并且確認，7個試驗的circRNA都與核糖體相關，其中5個與核糖體結(jié)合的堿基數(shù)目比沒結(jié)合的堿基數(shù)目要多。對于一些circRNA，很長的片段都與核糖體相關，提示這些circRNA在活躍的翻譯中。用能特異性干擾活躍翻譯核糖體的腺嘌呤素處理，發(fā)現(xiàn)與多核糖體相關的circRNA顯著減少，提示與多核糖體相關的circRNA就是因為活躍的翻譯。綜合以上，作者的研究表明，人轉(zhuǎn)錄組普遍存在著有編碼潛能的含m6A的circRNA。

• CircRNA junction上翻譯的內(nèi)源性肽段

為了直接鑒定由circRNA編碼的內(nèi)源性蛋白，作者開發(fā)了一個包含跨越所有已知circRNA back-splice junction序列所編碼的肽段的數(shù)據(jù)庫，將之與人蛋白數(shù)據(jù)庫UniProt聯(lián)合，檢測293細胞裂解物的MS/MS結(jié)果。

作者鑒定到了33個circRNA back-splice junction編碼的肽段，它們不與UniProt數(shù)據(jù)庫中任何蛋白匹配。MS/MS質(zhì)譜展示兩個代表樣品結(jié)果。為了進一步驗證候選的circRNA編碼的肽段，作者化學合成了其中兩條circRNA編碼的肽段，并且用這兩個肽段做了MS/MS。這兩個化學合成的肽段的MS/MS結(jié)果與細胞裂解物中原始肽段的MS/MS結(jié)果近似匹配，提示蛋白組學分析發(fā)現(xiàn)的肽段很可能是circRNA翻譯產(chǎn)生的。

Discuss

circRNA有大量的m6A修飾，足夠去驅(qū)動一種由m6A識別蛋白YTHDF3和翻譯起始因子eIF4G2參與的非帽子依賴的蛋白翻譯（下圖）。同時，很多circRNA被發(fā)現(xiàn)是與多核糖體相關的，提示有相當數(shù)量的內(nèi)源性circRNA是翻譯的。circRNA-m6A-seq仍能告訴我們m6A修飾在circRNA中很普遍的，提示我們，在人的轉(zhuǎn)錄組中，可翻譯的circRNA是普遍存在的。這個結(jié)果挑戰(zhàn)了把circRNA當做非編碼RNA的刻板觀點，同時也開啟了circRNA潛在功能的新研究方向。

這些發(fā)現(xiàn)同時引出一些很有趣的問題，比如，circRNA編碼蛋白可能的功能是什么。作者發(fā)現(xiàn)在熱激條件下，circRNA的翻譯是增加的，增加了circRNA編碼蛋白在壓力反應中扮演一定角色的可能性。有報道說，在癌癥中，非帽子依賴的通過IRES進行的翻譯是上升的，以促進基因的翻譯。這一機制在細胞應激反應、發(fā)展、凋亡及細胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用。因為circRNA是能通過非帽子依賴的途徑進行翻譯，因此作者推測circRNA的翻譯在癌細胞中可能很流行，當然這依然是個待確定的問題。此外，很多circRNA編碼N終端蛋白片段，能產(chǎn)生與傳統(tǒng)翻譯蛋白有重疊序列的蛋白異構(gòu)體。結(jié)果，有可能circRNA編碼的蛋白異構(gòu)體干擾相對經(jīng)典的蛋白的功能。同時，作者也發(fā)現(xiàn)一些短的沒有公認m6A motif序列也可以驅(qū)動circRNA的翻譯，意味著circRNA翻譯也可被一些非m6A依賴的機制驅(qū)動，或者是腺嘌呤的甲基化也可在非經(jīng)典位點發(fā)生。

此前一些非編碼RNA被報道有5’ORF編碼的潛能，然而體內(nèi)的m6A驅(qū)動的非帽子依賴的翻譯提示了另外一種更有說服力的非編碼RNA從內(nèi)部ORF開始的翻譯。因此，一個細胞的翻譯圖譜可能會對我們目前認為的更加復雜。就如一個基因可以通過可變剪接產(chǎn)生多個mRNA異構(gòu)體一樣，作者推測非帽子依賴的翻譯也可使一個mRNA被翻譯成多個不同的蛋白。