miRNA介導基因沉默的基本機制

Ana Eulalio, Eric Huntzinger and Elisa Izaurralde

Cell 132, 9 – 14, January 11, 2008

    微RNA是長度為22核苷的RNA，通過與標靶mRNA 3’非翻譯區(qū)結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄后的基因表達沉默。盡管對微RNA的生物合成和功能已有較多的了解，但在動物細胞中miRNA使基因表達沉默的機制尚無定論。我們在本文討論miRNA介導的基因沉默的各種模型，并闡述能消彌模型差異的假說。

    微RNA（miRNA）在發(fā)育、細胞分化、增殖和凋亡等許多生物學過程中起重要作用。最近的證據(jù)表明miRNA也與癌癥和代謝異常等人類疾病有關(guān)。在非脊椎動物中至少鑒定了100個miRNA基因，在脊椎動物和植物中已鑒定了500 – 1000個miRNA基因。根據(jù)對miRNA標靶的計算機預(yù)測，估計每個miRNA調(diào)節(jié)幾百個不同的mRNA，因此相當大一部分轉(zhuǎn)錄體可接受miRNA的調(diào)節(jié)。

    miRNA為了執(zhí)行調(diào)節(jié)功能，與Argonaute家族結(jié)合形成由miRNA誘導的沉默復(fù)合物(miRISC)。在這些復(fù)合物中，miRNA指導Argonaute蛋白進入完全或部分互補的mRNA標靶，使這些mRNA保持轉(zhuǎn)錄后沉默。

    盡管我們對miRNA生物合成和功能的理解正在不斷加深，但對miRNA用以調(diào)節(jié)基因表達的機制仍無定論。已發(fā)表的研究表明，miRNA以4種不同的方式抑制蛋白質(zhì)表達：（1）與翻譯偶聯(lián)的蛋白質(zhì)降解；（2）翻譯延長的抑制；（3）翻譯提前終止（核糖體脫落）；（4）翻譯起始的抑制。另外，盡管有不完全的mRNA—miRNA堿基配對，動物miRNA能夠誘導mRNA標靶大量降解。微RNA還可以在稱為mRNA加工體或P體（不存在翻譯機制）的獨立細胞質(zhì)位點，通過螯合mRNA使其沉默。我們在本文中討論這些不同的miRNA抑制機制的證據(jù)以及這些機制的差異。

翻譯起始后的抑制機制

    早期在線蟲中的研究以及最近在哺乳動物細胞培養(yǎng)物中的研究提供了miRNA在翻譯起始后抑制蛋白質(zhì)合成的有利證據(jù)。盡管這些研究的細節(jié)有所不同，但其結(jié)論都來自一個共同的觀察，即miRNA及其標靶在蔗糖沉降梯度中與多聚核糖體結(jié)合在一起。因為這些多聚核糖體對各種抑制翻譯的條件敏感，說明它們有翻譯mRNA標靶的活性。例如，這些多聚核糖體與多羥基瑙醇、嘌呤霉素或密旋霉素等翻譯抑制劑短暫保溫后，可分離成核糖體單體或核糖體亞基。

    miRNA的標靶明顯可被有效翻譯，但卻檢測不到相應(yīng)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，人們從這種自相矛盾的觀察中提出了新生多肽鏈可能在翻譯的同時被降解的假說。然而，這種假說是建立在負結(jié)果，而不是建立在直接的正面證據(jù)上。例如，假定的蛋白酶的性質(zhì)尚不清楚。蛋白酶體參與的可能性已被排除，因為蛋白酶體抑制劑無法恢復(fù)沉默的報告mRNA的蛋白質(zhì)表達。

    為了研究miRNA如何使標靶沉默，Petersen等設(shè)計了一個含有3’非翻譯區(qū)(3’ UTR)的合成的miRNA報告mRNA，其3’ UTR帶有6個與轉(zhuǎn)染siRNA（miRNA類似物）部分互補的相同位點。當這個報告mRNA瞬時表達時，它與多聚核糖體結(jié)合，盡管siRNA抑制它的表達。但是如果翻譯起始受到抑制，這些核糖體的解離要比與對照（無抑制）mRNA結(jié)合的核糖體的解離更快。由此產(chǎn)生了miRNA引發(fā)核糖體提前解離或核糖體脫落的假說。

    miRNA介導翻譯起始后的抑制還有另外的證據(jù)：即使是通過含有一個內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)的5’ UTR啟動的報告mRNA的翻譯，也會發(fā)生沉默。因為IRES啟動的mRNA的翻譯與與mRNA帽結(jié)構(gòu)無關(guān)，所以這些結(jié)果表明miRNA是在帽識別之后的階段抑制翻譯。

翻譯起始的抑制

    與上述研究不同，Pillai等展示了miRNA及其標靶在蔗糖梯度中不與多聚核糖體結(jié)合，而是與哺乳動物細胞中的自由mRNP結(jié)合，這說明翻譯抑制發(fā)生在起始階段。另外，在上述以及在其他研究中，通過不依賴帽的機制（即通過IRES）進行翻譯的mRNA很難再被miRNA所抑制，這進一步支持miRNA抑制依賴于帽的翻譯起始的論點。

    與miRNA在阻斷翻譯起始中起作用相吻合的是，Kiriakidou等報道了一個出人意料的觀察：Argonaute蛋白的中心結(jié)構(gòu)域與細胞質(zhì)帽結(jié)構(gòu)蛋白eIF4E（真核翻譯起始因子4E）有序列相似性，eIF4E是依賴于帽的翻譯起始所必需的。eIF4E通過在處于兩個色氨酸之間的帽的甲基化堿基上的堆積，與mRNA的m⁷Gppp-帽結(jié)構(gòu)結(jié)合。在與eIF4E的色氨酸相對應(yīng)的位置上，Argonaute蛋白有可介導類似相互作用的苯丙氨酸。類似的發(fā)現(xiàn)還有Kiriakidou展示的人Argonaute2(AGO2)與葡聚糖凝膠珠上的m⁷GTP的結(jié)合，甲基化帽類似物（如m⁷GpppG）可與這種結(jié)合形式競爭，而非甲基化m⁷GpppG不能形成競爭。這些研究人員進一步展示了用纈氨酸置換一個或兩個AGO2苯丙氨酸可消除基因沉默活性。這些結(jié)果支持miRNA通過從帽結(jié)構(gòu)中置換eIF4E，在帽識別步驟抑制翻譯。

    Chendrimada等報道的證據(jù)也說明miRNA抑制一個早期翻譯步驟（在延長步驟之前）。他們用人細胞展示了AGO2可與eIF6以及核糖體大亞基結(jié)合。eIF6通過與核糖體大亞基結(jié)合，防止大亞基過早地與核糖體小亞基連接。如果AGO2使eIF6與之結(jié)合，核糖體的大亞基和小亞基則可能無法結(jié)合，導致翻譯受到抑制。

    盡管Kiriakidou和Chendrimada都提供了miRNA在翻譯延長步驟之前抑制翻譯的研究結(jié)果，但他們提出了相互排斥的基本機制。我們必須更全面地研究eIF6和Argonaute的帽結(jié)合結(jié)構(gòu)域怎樣在mRNA沉默中起作用。特別是在沒有關(guān)于真核Argonaute蛋白結(jié)構(gòu)信息的情況下，對Kiriakidou的研究結(jié)果的另一種可能的解釋是，苯丙氨酸的突變可通過一種不同的機制影響該蛋白質(zhì)的活性。而eIF6是核糖體60S亞基生物合成所必需的，它的缺失可能有我們不完全了解的其他影響。

miRNA介導的mRNA降解

    最初的研究曾報道動物miRNA抑制翻譯，對標靶mRNA的豐度沒有多大影響。然而最近的研究報告表明動物miRNA確實導致標靶大量降解。這方面的證據(jù)包括，在miRNA途徑受到抑制（如去除Dicer或Argonaute蛋白）的細胞中，預(yù)期的有功能的miRNA標靶的水平增加。相反，如果特定miRNA異常表達，含有這些miRNA結(jié)合位點的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的豐度就會減少。同樣，有幾個例子說明特定miRNA的表達與含有互補結(jié)合位點的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的減少有相關(guān)性。例如，在斑馬魚胚胎的配子轉(zhuǎn)錄啟動時，miR-430表達的大量增加伴隨有在3’ UTR含miRNA位點的母系mRNA的大量降解。

    在動物細胞中，miRNA不是通過Argonaute蛋白的內(nèi)切核苷水解切割降解mRNA，而是將mRNA送到普通mRNA降解機制中（除非miRNA與標靶完全互補）。在斑馬魚胚胎、線蟲、果蠅和人細胞中對miRNA加速其標靶的脫腺苷化和脫帽的研究支持上述觀察。

    miRNA介導的信使RNA降解需要Argonaute蛋白、P體組分GW182、CAF1-CCR4-NOT脫腺苷酶復(fù)合物、脫帽酶DCP2和幾種脫帽活化因子（包括DCP1, EDC3和RCK/p54）。目前的證據(jù)表明GW182通過直接作用于Argonaute蛋白而與miRNA標靶聚集，從而在翻譯抑制中起作用。GW182也是通過脫腺苷化和脫帽降解的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物標靶的標記。

    盡管有重要證據(jù)顯示miRNA啟動標靶的降解，但仍有一個懸而未決的重要問題：標靶降解是一個造成沉默的獨立機制還是由于影響翻譯而造成標靶降解？某些證據(jù)表明miRNA介導的mRNA降解不與翻譯偶聯(lián)。在人細胞中，可通過在miRNA標靶的5’ UTR插入一個強力莖環(huán)結(jié)構(gòu)抑制標靶的翻譯，但這種標靶仍然以依賴于miRNA的方式脫腺苷。同樣，在斑馬魚胚胎和人細胞抽提物中，盡管miRNA標靶有可破壞翻譯的缺損的帽結(jié)構(gòu)(Appp-帽)，但它們?nèi)钥擅撓佘?。此外，在果蠅細胞和人細胞抽提物中，在不進行翻譯時亦可發(fā)生miRNA介導的mRNA降解。

    降解的程度明顯是由mRNA標靶而不是由miRNA決定，這是因為相同的的miRNA可以標靶專一性方式抑制翻譯或誘導mRNA降解。Aleman等發(fā)現(xiàn)miRNA是進行降解還是進行翻譯抑制取決于miRNA-mRNA二聚體的結(jié)構(gòu)（即誤配的數(shù)量、類型和位置）。Grimson等發(fā)現(xiàn)miRNA結(jié)合位點的數(shù)量、位點之間的距離以及在3’ UTR中的位置和RNA的環(huán)境都強烈影響調(diào)節(jié)的程度，盡管在每種情況中翻譯抑制和降解的相對作用尚不清楚。因此，miRNA是否進行mRNA降解主要取決于miRNA結(jié)合位點和RNA環(huán)境的特定性質(zhì)，最可能的決定因素是miRNA與特定標靶結(jié)合蛋白的特殊相互作用。

在P體的螯合

    Argonaute蛋白、miRNA和miRNA標靶共處于一個稱為P體的細胞質(zhì)位點。P體的其他組分，如GW182、CAF-CCR4-NOT脫腺苷酶復(fù)合物、脫帽酶DCP2、脫帽激活因子（如DCP-1、EDC3、Ge-1）和RNA解旋酶RCK/p54等都參與miRNA功能。

    Argonaute蛋白、miRNA和miRNA標靶在P體的測定產(chǎn)生了一個miRNA標靶在P體中螯合的模型，即miRNA標靶與翻譯隔絕并可能被降解。人們對miRNA定位于P體是mRNA沉默的原因還是結(jié)果仍無定論。然而，最近的研究證實，在缺少可探測到的微小P體的細胞中，miRNA途徑并不受影響。因此盡管P體組分在miRNA介導的基因沉默中起重要作用，但miRNA的功能并不需要這些組分聚集成為微型P體。這些結(jié)果說明基因沉默是在可溶性細胞質(zhì)部分開始的，但是沉默機制在P體的定位并不是沉默的原因，而是它的結(jié)果。

體外研究的結(jié)果

    miRNA對翻譯起始的抑制已在各種來源的無細胞抽提物的體外研究中得到重復(fù)，包括兔網(wǎng)織紅細胞裂解物、果蠅胚胎抽提物以及兩種哺乳動物細胞系（小鼠Krebs-2腹水和人HEK293F細胞）的抽提物。miRNA可在上述抽提物中使有m⁷Gppp帽的mRNA的翻譯沉默，但不能使有合成的Appp帽結(jié)構(gòu)（與polyA尾無關(guān)）的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯沉默。在小鼠和人細胞抽提物中，以依賴于IRES方式啟動翻譯的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物很難被miRNA調(diào)節(jié)。

    對poly(A)尾在沉默中的作用研究的很少，在正式研究這個問題時，無多聚腺苷化的mRNA或者在體內(nèi)沉默，或者在體內(nèi)和體外都不沉默或部分沉默，與帽結(jié)構(gòu)無關(guān)。

    Wakiyama等觀察到了mRNA沉默確實需要帽結(jié)構(gòu)和poly(A)尾。他們的細胞抽提物還重復(fù)了早先在斑馬魚胚胎以及在人和果蠅細胞中觀察到的miRNA介導的脫腺苷化。根據(jù)這些觀察，Wakiyama等提出miRNA啟動脫腺苷化。在他們的模型中，翻譯受到抑制是由于無法合成帽結(jié)構(gòu)和poly(A)尾。人們已清楚知道如果細胞質(zhì)poly(A)結(jié)合蛋白(PABPCI)與mRNA的poly(A)尾結(jié)合，它可以與翻譯起始因子4G(eIF4G)相互作用。eIF4G通過與eIF4E的相互作用與帽結(jié)構(gòu)結(jié)合。這種相互作用誘導mRNA形成一個閉環(huán)，可極大地增加翻譯。沉默的mRNA不能形成閉環(huán)，因為這些mRNA已被脫腺苷化。

    值得注意的是，對脫腺苷化是基因沉默的原因還是結(jié)果仍有爭議。Wakiyama發(fā)現(xiàn)所有含miRNA結(jié)合位點的mRNA都以依賴于miRNA的方式脫腺苷化，包括由于在5’ UTR有Appp帽或IRES而不能沉默的mRNA。這項發(fā)現(xiàn)與在斑馬魚胚胎中報道的結(jié)果一致。脫腺苷化在環(huán)己胺存在時仍可發(fā)生，說明它不需要和翻譯同時進行。這些結(jié)果可看作是脫腺苷化引起翻譯抑制的證據(jù)。

    其他研究表明除了脫腺苷化，還有另外一些引起翻譯抑制的機制。例如，在果蠅細胞中去除脫腺苷酶復(fù)合物中的一個必要組分（NOT1），可阻止miRNA介導的mRNA降解，但并不能使蛋白質(zhì)表達完全恢復(fù)，這說明報告mRNA仍在翻譯水平保持沉默。與之類似的是，Wu等表明在人細胞中，poly(A)尾被一個組蛋白莖—環(huán)結(jié)構(gòu)置換后的報告mRNA仍受miRNA的抑制，這說明翻譯抑制不是由脫腺苷化引起的。

    Mathonnet等報道了一個重要發(fā)現(xiàn)：加入純化的起始復(fù)合物eIF4F(其中包括細胞質(zhì)帽結(jié)合蛋白eIF4E、支架蛋白eIF4G和RNA解旋酶eIF4A)能阻止mRNA沉默。Kiriakidou等提出過Argonaute蛋白與eIF4E競爭對帽結(jié)構(gòu)的結(jié)合，上述觀察與他們的觀點完全吻合。eIF4E的更換可阻止mRNA環(huán)化，因而增加脫腺苷化?？偠灾?，盡管體外研究有細節(jié)上的不同，但都表明miRNA干擾翻譯起始的早期階段。

為什么有如此多的反應(yīng)機制？

    協(xié)調(diào)miRNA調(diào)節(jié)基因表達的各種已有模型是很困難的。也許這些不同的模型反映了不同的解釋和不同的實驗方法。另一種可能性是miRNA確實需要通過多種機制來抑制基因表達。還有一種可能性是miRNA需要通過一種共同的單一機制使基因表達沉默，已有的各種反應(yīng)模型是這種基本機制的次級反應(yīng)。

我們是否在測定基因沉默中的關(guān)鍵因素？

    原則上我們可以通過分析沉默的報告mRNA在蔗糖沉降梯度中的位置，輕易地將miRNA介導的翻譯抑制的后起始模型與起始模型加以區(qū)分。在第一種模型中，報告mRNA應(yīng)與多聚核糖體處于蔗糖梯度的相同部分中，而在第二中模型中，報告mRNA應(yīng)該在蔗糖梯度的自由RNP部分（即在梯度的頂部）。不幸的是，這些實驗沒有給出確切的結(jié)果，因此很難對結(jié)果進行解釋。

    首先，除了EDTA處理外，大多數(shù)解離多聚核糖體的條件（如嘌呤霉素、多羥基瑙醇或密旋霉素處理）不能定量地將mRNA從多聚核糖體部分轉(zhuǎn)移到mRNP部分，而是將其從較重的部分轉(zhuǎn)移到較輕的部分。這種轉(zhuǎn)移在某些情況中屬于實驗的測定誤差。第二，miRNA的抑制作用是在2—5倍的范圍。因此，20%到50%的報告mRNA不沉默。報告mRNA群體的這種不均一性可能影響實驗結(jié)果。第三，一部分受到抑制的mRNA可能會部分降解（大多數(shù)研究不能排除報告mRNA有10%—15%的降解）。根據(jù)調(diào)節(jié)的程度，這可能代表相當一部分沉默的mRNA。

    由于上面提到的困難，很明顯沉降圖并不能提供支持或否定某一機制的明確證據(jù)。出于對上述方法局限性的警惕，許多研究使用一個獨立的方法以便得到正確的結(jié)論。IRES的使用是這種獨立方法之一。在特定研究中，用含有IRES的報告mRNA得到的結(jié)果與多聚核糖體沉降圖分析結(jié)果一致，但在不同的研究中結(jié)果很不相同，說明存在實驗偏差。

實驗方法的偏倚？

    大多數(shù)翻譯起始受到抑制的證據(jù)來自對體外合成后再與無細胞抽提物一起保溫的mRNA的研究，或來自對轉(zhuǎn)染進入培養(yǎng)細胞的mRNA的研究。miRNA標靶在體內(nèi)并不是“裸”mRNA，而是以核糖核蛋白體或mRNP形式存在。一般認為RNA結(jié)合蛋白是在轉(zhuǎn)錄時或在加工期間與mRNA結(jié)合。因此與體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的mRNA完全互補的蛋白質(zhì)可能不同于在體外系統(tǒng)或在mRNA轉(zhuǎn)染后與mRNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。這也許可以解釋某些研究中觀察到的差異，如在Humphreys等人和在Petersen等人的研究中出現(xiàn)的差異。這些研究的意義是RNA結(jié)合蛋白對miRNA的終極調(diào)節(jié)作用有很大的影響。

    研究分歧的另一個來源是報告mRNA的性質(zhì)。某些研究使用的人工報告mRNA在非同源的3’ UTR中含有多個相同的miRNA結(jié)合位點。為了達到有效的基因沉默，這些人工報告mRNA需要有多達6個miRNA結(jié)合位點，而天然的3’ UTR很少有6個等距離的相同miRNA結(jié)合位點。因此人工報告mRNA可能無法完全重現(xiàn)miRNA的調(diào)節(jié)。另外，在使用這類報告mRNA時，可能會觀察到不同的機制，所以僅依據(jù)這些報告mRNA無法解釋在實驗中觀察到的所有差異。

    其他的實驗差異存在于是使用體內(nèi)轉(zhuǎn)錄加工的miRNA還是使用轉(zhuǎn)染的siRNA。如果報告mRNA含有部分互補的miRNA結(jié)合位點，一般認為siRNA可進行miRNA的反應(yīng)。然而，目前尚不清楚在人細胞中，雙鏈miRNA或siRNA中間物的生物合成途徑或結(jié)構(gòu)怎樣影響miRNA或siRNA與哪一種Argonaute蛋白結(jié)合。在果蠅的研究中已證實，是微小的RNA雙鏈結(jié)構(gòu)而非生物合成途徑?jīng)Q定哪一種含有Argonaute的復(fù)合物與miRNA或siRNA結(jié)合。如果在人細胞中也是如此，內(nèi)源miRNA和轉(zhuǎn)染的siRNA將與不同的Argonaute復(fù)合物結(jié)合。

    一共有4種人Argonaute同源蛋白，它們可能都是通過類似的機制（盡管尚未得到深入研究）抑制翻譯。大多數(shù)研究沒有建立哪一種Argonaute同源蛋白具有基因沉默活性。這引發(fā)了下列問題：不同的Argonaute蛋白是通過相同的還是不同的分子機制使互補的標靶沉默？由此產(chǎn)生的推論是不同研究中的差異是否反映了不同的Argonaute蛋白或具有不同蛋白組分的Argonaute復(fù)合物的不同反應(yīng)？含有mRNA—蛋白質(zhì)復(fù)合物的Argonaute的生化純化揭示了與個別Argonaute蛋白結(jié)合的mRNA確實不完全相同，這說明存在一定程度的標靶選擇專一性。

多重機制還是多種輸出？

    對天然全長3’ UTR進行比較的研究指出，miRNA調(diào)節(jié)的最終影響取決于標靶3’ UTR的特征和序列。在這些研究中，就每一對miRNA標靶而言，翻譯抑制或mRNA降解對基因沉默有不同的影響。

    應(yīng)力條件進一步為3’ UTR周圍序列的重要性提供了證據(jù)，因為諸如HuR類蛋白與陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白1(CAT-1)mRNA的3’ UTR的結(jié)合可解除miR-122介導的基因沉默。盡管還不清楚HuR是直接置換miR-122還是通過反式作用間接影響其功能，但其他的RNA結(jié)合蛋白也很可能通過標靶專一性方式阻止、調(diào)節(jié)或影響miRNA調(diào)節(jié)的內(nèi)容和方式。RNA結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)miRNA功能的例子正在不斷增加。

    然而，miRNA仍可能是通過一個共同的單一機制使表達沉默，多種反應(yīng)模式只是反映了這種基本機制的次級影響，而并非是獨立的機制。這些次級影響可以因細胞或標靶的不同而發(fā)生變化。例如，翻譯抑制可能是一個按照標靶或細胞專一性發(fā)揮作用的基本機制，它可以引起也可以不引起mRNA降解。與標靶mRNA結(jié)合的蛋白質(zhì)確實可以影響降解。細胞專一性也可能影響降解。例如，在體細胞中，斑馬魚nanos1 mRNA通過miR-430脫腺苷化和降解，但在生殖細胞中很難進行同樣的miR-430的調(diào)節(jié)。

    同樣，人們可以想象與翻譯同時發(fā)生的蛋白質(zhì)降解是在翻譯延長過程中發(fā)生的基本機制的作用結(jié)果。沉默的核糖體可發(fā)出諸如新生肽鏈受到降解的翻譯異常信號。Nottrott等曾經(jīng)描述過新生肽在翻譯同時被降解的例子。

結(jié)論

    越來越多的證據(jù)表明miRNA在人類疾病中，如在癌癥、神經(jīng)疾病、代謝疾病和病毒感染中起重要作用。對miRNA介導的基因調(diào)節(jié)機制的深入理解，對評估m(xù)iRNA作為潛在治療標靶至關(guān)重要。盡管我們已開始理解miRNA的生物合成并鑒定了重要的miRNA功能影響因子，但miRNA在動物細胞中的作用模式仍有極大爭議。我們認為目前所觀察到的不同的機制不太可能是由于不同的技術(shù)方法。相反，我們傾向于認為以不同方式出現(xiàn)的miRNA抑制作用取決于mRNA標靶的特征和組分。目前我們無法判斷這些不同的抑制模式是代表多個不同的沉默機制還是代表一個單一基本機制的多種作用結(jié)果。