小鼠MS腦區(qū)注射AAV-DIO-GCaMp6M后，在MS植入光纖，用牙科水泥固定。單籠飼養(yǎng)3周使熒光蛋白充分表達(dá)并讓小鼠恢復(fù)狀態(tài)。光纖記錄熒光信號(hào)時(shí)，從488nm激光器射出一束激發(fā)光，經(jīng)過(guò)二項(xiàng)色鏡的反射，由^*10物鏡匯聚，通過(guò)一條光纖跳線與小鼠頭部植入的光纖射入對(duì)應(yīng)腦區(qū)。激發(fā)的GCaMP熒光通過(guò)濾波后，被光電倍增器采集，再通過(guò)放大器將光電倍增管電流信號(hào)轉(zhuǎn)化為電壓信號(hào)。再由低頻過(guò)濾器過(guò)濾，模擬的電壓信號(hào)在500Hz轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)再記錄。記錄到的鈣信號(hào)在后期通過(guò)人工打標(biāo)與對(duì)應(yīng)行為匹配，并經(jīng)過(guò)Matelab程序分析輸出熱圖和統(tǒng)計(jì)圖。

攝食實(shí)驗(yàn)

小鼠提前一天禁食12個(gè)小時(shí)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，小鼠在黑暗環(huán)境中適應(yīng)一個(gè)小時(shí)。通過(guò)頭部光纖連接光纖記錄系統(tǒng)，放入20＊20＊22cm的透明盒子中，盒子內(nèi)放入一小塊鼠糧。盒子上方安裝紅外攝像頭進(jìn)行錄像。在黑暗環(huán)境下記錄小鼠接觸并進(jìn)食的時(shí)間以及鈣信號(hào)數(shù)據(jù)。

糖水實(shí)驗(yàn)

小鼠斷水12后放入20＊20＊22cm的透明盒子中，盒子上安裝一個(gè)給水瓶供小鼠自由舔食。瓶口的金屬導(dǎo)管上通過(guò)導(dǎo)線連接到儀器檢測(cè)小鼠每次舔食糖水的次數(shù)和時(shí)間，黑暗環(huán)境下記錄小鼠每次獲取糖水的時(shí)間點(diǎn)以及鈣信號(hào)數(shù)據(jù)?？谇粌?nèi)給予糖水以及奎寧，通過(guò)小鼠臉頰在小鼠口腔內(nèi)植入導(dǎo)管，將導(dǎo)管另一端用牙科水泥固定在小鼠頭部。實(shí)驗(yàn)時(shí)，通過(guò)小鼠頭部的導(dǎo)管連接微量注射泵，在小鼠口腔內(nèi)給予糖水和奎寧。糖水實(shí)驗(yàn)中，小鼠提前斷水12個(gè)小時(shí)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，通過(guò)微量注射泵每20-30s給小鼠口腔內(nèi)注入糖水（5% w/v），速度為20ul/s，持續(xù)時(shí)間為0.5s?？鼘巺拹簩?shí)驗(yàn)中，小鼠不需要提前斷水，奎寧的濃度為5mM。給藥方式與給糖水相似。記錄下每次給糖水，奎寧的時(shí)間點(diǎn)，以及整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的鈣信號(hào)。

足底電擊實(shí)驗(yàn)

小鼠放入透明塑料盒子中，底部為金屬網(wǎng)格板。實(shí)驗(yàn)時(shí)，小鼠每20-40s內(nèi)被給予0.7mA，0.5s的電擊。持續(xù)4次。記錄小鼠每次接受電擊的時(shí)間，以及整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的鈣信號(hào)。

足底電擊快速激活MS腦區(qū)膽堿能神經(jīng)元

足底電擊實(shí)驗(yàn)是常用的應(yīng)激手段，被廣泛用于小鼠的恐懼記憶以及創(chuàng)傷后應(yīng)激綜合征（PTSD）的研究。因此首先檢測(cè)MS膽堿能神經(jīng)元在小鼠受到電刺激時(shí)的神經(jīng)元活動(dòng)的變化。小鼠在實(shí)驗(yàn)籠內(nèi)適應(yīng)2分鐘后，每隔20-40秒給予小鼠一次足底電擊，電流強(qiáng)度為0.7mA，持續(xù)0.5s。發(fā)現(xiàn)小鼠在受到電擊時(shí)，鈣信號(hào)的強(qiáng)度明顯増加，又快速恢復(fù)到正常水平。在所有的病毒充分表達(dá)，光纖埋植位置正確的小鼠上都看到了上升的鈣信號(hào)反應(yīng)。這表明足底電擊的應(yīng)激刺激顯著的增強(qiáng)了MS這群膽堿能神經(jīng)元的活動(dòng)。同時(shí)，反復(fù)電擊刺激增強(qiáng)了這群膽堿能神經(jīng)元對(duì)刺激的反應(yīng)強(qiáng)度。

足底電擊快速激活MS腦區(qū)膽堿能神經(jīng)元

A足底電擊行為實(shí)驗(yàn)示意圖；

B小鼠在整個(gè)行為檢測(cè)周期內(nèi)足底電擊引起MS膽堿能神經(jīng)元鈣信號(hào)改變的熱圖，0s表示電擊刺激的開始，縱坐標(biāo)表示刺激事件的次數(shù)，橫坐標(biāo)表示每次刺激前后記錄的鈣信號(hào)的時(shí)間，比色尺表示熱圖中△F/F的變化范圍；

C一只小鼠足底電擊引起鈣信號(hào)改變的線性圖，0s表示電擊刺激的開始，紅色實(shí)線表示所有事件中鈣信號(hào)改變的平均值，灰色陰影表示所有事件信號(hào)改變的標(biāo)準(zhǔn)誤；

D實(shí)驗(yàn)中電擊引起的所有小鼠鈣信號(hào)改變的線性，每一種顏色的線表示一只小鼠在整個(gè)刺激過(guò)程的鈣信號(hào)變化的平均值；

E實(shí)驗(yàn)小鼠足底電擊前后鈣信號(hào)改變的平均值的統(tǒng)計(jì)分析；

F所有實(shí)驗(yàn)小鼠每次電刺激引起的鈣信號(hào)變化的峰值的平均值的變化。

奎寧引起的苦味感受激活MS膽堿能神經(jīng)元

運(yùn)用足底電擊和懸尾刺激的刺激方式，可看到應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中小鼠MS膽堿能神經(jīng)元的興奮性顯著增加。然而，這兩個(gè)刺激屬于強(qiáng)烈的軀體感覺(jué)刺激，小鼠在遭受刺激時(shí)會(huì)出現(xiàn)明顯的掙扎逃跑的運(yùn)動(dòng)行為。這可能影響到結(jié)論的可靠性。因此引入應(yīng)外一種應(yīng)激刺激，即通過(guò)口腔給予奎寧溶液產(chǎn)生苦的味覺(jué)體驗(yàn)。首先，經(jīng)過(guò)手術(shù)作者在小鼠臉頰上開一個(gè)口，通過(guò)這個(gè)口往口腔內(nèi)植入一根導(dǎo)管用于口腔內(nèi)給藥。導(dǎo)管的另一側(cè)通過(guò)牙科水泥固定在小鼠頭部。這樣就可以通過(guò)外接給藥泵往小鼠口腔內(nèi)給奎寧溶液。實(shí)驗(yàn)時(shí)，通過(guò)注射泵，隨機(jī)的往小鼠口腔內(nèi)注射奎寧溶液（5MM），速度為20 μL/s，每次持續(xù)0.5s?？谇粌?nèi)給予奎寧后記錄到的鈣信號(hào)的值明顯增加，并且在結(jié)束給藥之后的數(shù)十秒內(nèi)鈣信號(hào)的水平仍然維持在較高水平。在所有的實(shí)驗(yàn)小鼠上都看到了類似的結(jié)果。這表明苦味的刺激會(huì)持續(xù)激活MS膽堿能神經(jīng)元的活性。

奎寧引起的苦味感受激活MS膽堿能神經(jīng)元

A小鼠口腔內(nèi)給予奎寧溶液示意圖。

B小鼠在整個(gè)行為檢測(cè)周期內(nèi)奎寧刺激引起MS膽堿能神經(jīng)元鈣信號(hào)改變的熱圖。

C小鼠奎寧刺激引起的鈣信號(hào)反應(yīng)的線性圖。

D所有實(shí)驗(yàn)小鼠的鈣信號(hào)改變的線性圖。

E實(shí)驗(yàn)小鼠奎寧刺激前后鈣信號(hào)改變的平均值的統(tǒng)計(jì)分析。