單抗融合是一項(xiàng)關(guān)鍵的生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)，用于制備單克隆抗體。以下是一份詳細(xì)的單抗融合操作步驟指南，基于最新的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和實(shí)踐。

一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1. 實(shí)驗(yàn)器材與試劑

在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，請(qǐng)確保以下器材和試劑已準(zhǔn)備齊全：

·         細(xì)胞融合所需器材：離心管、離心管架、剪子、鑷子、勻漿器、細(xì)胞篩網(wǎng)、培養(yǎng)皿、固定板等。

• 細(xì)胞融合所需試劑：1640不完全培養(yǎng)基MAC0016、PEG融合劑（如PEG1450）MAC0011、HAT完全培養(yǎng)基MAC0013、胎牛血清MAC0010、雙抗（鏈霉素和青霉素）、HAT或HT選擇性培養(yǎng)基等。

2. 試劑配制

·         實(shí)驗(yàn)前取PEG融合劑（如PEG1450）1ml于無(wú)菌EP管中，置于37℃預(yù)溫。

·         HAT完全培養(yǎng)基：按照20%胎牛血清+1%雙抗+1/50體積的HAT（50×）+1640不完全培養(yǎng)基的比例配制，每塊96孔板約需20ml，同樣置于37℃預(yù)溫。

·         分取50ml 1640不完全培養(yǎng)基，同樣置于37℃預(yù)溫，用于融合后稀釋PEG。

二、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作

·         將實(shí)驗(yàn)所需器材放入超凈臺(tái)，紫外照射30分鐘左右，以確保無(wú)菌環(huán)境。

三、飼養(yǎng)細(xì)胞與融合細(xì)胞準(zhǔn)備

1. 飼養(yǎng)細(xì)胞的制備

飼養(yǎng)細(xì)胞可以輔助融合雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，但也可能增加污染風(fēng)險(xiǎn)，需謹(jǐn)慎操作。

·         取空白Balb/c小鼠，眼球取血處死，浸入75%乙醇中消毒5分鐘。

·         將小鼠固定在無(wú)菌固定板上，剖開(kāi)腹部皮膚，用注射器向腹腔內(nèi)注入1640不完全培養(yǎng)基，輕輕按摩后回收。

·         取出小鼠脾臟，剪去表面脂肪，放入勻漿器中研磨，并通過(guò)細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾。

·         將過(guò)濾后的細(xì)胞懸液離心，棄上清，重懸于HAT完全培養(yǎng)基中，即可用于鋪板或混合鋪板。

2. SP2/0細(xì)胞制備

SP2/0細(xì)胞MAC0022作為骨髓瘤細(xì)胞，是單抗融合的重要組成部分。

·         對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞，直接吹打懸浮后離心計(jì)數(shù)使用。

·         對(duì)于實(shí)體瘤SP2/0，需按飼養(yǎng)細(xì)胞制備步驟處理小鼠，取出實(shí)體瘤后研磨、過(guò)濾、離心，重懸于1640不完全培養(yǎng)基中備用。

四、單抗融合操作步驟

1. 細(xì)胞混合與離心

·         用1640不完全培養(yǎng)基將SP2/0細(xì)胞和免疫鼠脾細(xì)胞重懸，分別計(jì)數(shù)后按一定比例（如脾細(xì)胞/0細(xì)胞=1:3）混合于50ml無(wú)菌離心管中。

·         加入適量1640不完全培養(yǎng)基至總體積約40ml，離心（如1500rpm，5分鐘）使細(xì)胞沉淀。

2. 融合劑PEG的加入與稀釋

·         離心后棄去上清液及管壁液體，輕輕敲打離心管底部使細(xì)胞沉淀松動(dòng)。

·         將離心管底部浸入37℃溫水中保持溫度。

·         從培養(yǎng)箱中取出已預(yù)溫的PEG融合劑，在60秒內(nèi)均勻滴入細(xì)胞混合沉淀中，邊滴加邊轉(zhuǎn)動(dòng)離心管。

·         靜置溫育45秒后，開(kāi)始稀釋融合劑。取出預(yù)熱的1640不完全培養(yǎng)基，先取1ml在60秒內(nèi)均勻滴入沉淀中，再取1ml在30秒內(nèi)滴入，最后將剩余的45ml培養(yǎng)基慢慢滴入并混勻。

3. 細(xì)胞重懸與鋪板培養(yǎng)

·         稀釋融合劑后，輕輕顛倒混勻離心管內(nèi)的細(xì)胞懸液，再次離心（如1500rpm，5分鐘）并棄去上清液。

• 用含有飼養(yǎng)細(xì)胞的HAT完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀（如總體積200ml）。若飼養(yǎng)細(xì)胞已提前鋪板，則只需用100ml的HAT完全培養(yǎng)基重

·         將重懸后的細(xì)胞均勻鋪入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中（如200μl/孔），置于5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

·         培養(yǎng)7天后，用HAT完全培養(yǎng)基換液一半。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，也可選擇半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)方式。

五、雜交瘤細(xì)胞篩選與亞克隆

1. 陽(yáng)性細(xì)胞孔的篩選

·         一般采用間接ELISA法篩選陽(yáng)性細(xì)胞孔。需先確定抗原最佳包被濃度并建立好ELISA檢測(cè)方法。

·         按最佳包被濃度包被ELISA板后，加入雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)OD值選取陽(yáng)性值最高的孔予以保留并進(jìn)行亞克隆。

2. 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的亞克隆

·         亞克隆的目的是為了得到單個(gè)細(xì)胞（單克?。┓至焉L(zhǎng)的細(xì)胞群。一般采用有限稀釋法或半固體培養(yǎng)基法進(jìn)行亞克隆。

·         在亞克隆過(guò)程中需使用HT完全培養(yǎng)基等選擇性培養(yǎng)基以促進(jìn)雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。

六、注意事項(xiàng)

·         在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范以防止污染。

·         融合劑PEG的分子量和濃度需根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行選擇和優(yōu)化。

• 飼養(yǎng)細(xì)胞的使用需謹(jǐn)慎操作以避免對(duì)融合造成負(fù)面影響。

• 特別推薦使用用雜交瘤添加因子10×MAC0014

·         在雜交瘤細(xì)胞篩選和亞克隆過(guò)程中需耐心觀察和細(xì)致操作以確保實(shí)驗(yàn)成功。

以上單抗融合操作步驟僅供參考，具體實(shí)驗(yàn)條件可能因?qū)嶒?yàn)室設(shè)備、試劑品牌等因素而有所不同。在實(shí)際操作中請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整和優(yōu)化。另外推出單抗融合套裝MAC0001，新手操作首選.