細(xì)胞對內(nèi)部或外部刺激的反應(yīng)是不同的，要理解細(xì)胞的分子狀態(tài)如何影響細(xì)胞對諸如炎癥信號或分化刺激等的反應(yīng)速度和程度具有挑戰(zhàn)性。主要的障礙是大多數(shù)全基因組分析方法會破壞細(xì)胞，這使得后續(xù)的分子或表型實驗無法在同一細(xì)胞上進(jìn)行

近年來，為了避免破壞性采樣，已經(jīng)幾種細(xì)胞分析方法被開發(fā)，可大致分為兩類。首先，通過純計算方法將根據(jù)快照測量推斷細(xì)胞的過去狀態(tài)，或通過將相似的細(xì)胞狀態(tài)連接到連續(xù)的軌跡，或通過建模mRNA剪接動態(tài)。盡管這些工具生成的模型很有見地，但這只是統(tǒng)計建模出來的數(shù)據(jù)，而不是細(xì)胞的實際過渡路徑。此外，這些技術(shù)是否能夠在更長的時間尺度和個體基因水平上正確推斷細(xì)胞過去的狀態(tài)仍有爭議。第二類方法將標(biāo)記一個細(xì)胞或它的一些分子。例如，mRNA的代謝標(biāo)記可以區(qū)分新合成的mRNA分子和舊的mRNA分子。也可以對細(xì)胞進(jìn)行基因標(biāo)記，然后對其子細(xì)胞進(jìn)行獨立的分子或表型分析。

盡管這些分子方法很強(qiáng)大，但它們通常只適用于很短的時間尺度或每個細(xì)胞的一些特征，并且依賴于幾個生物學(xué)假設(shè)來推斷細(xì)胞的初始狀態(tài)。這些假設(shè)包括細(xì)胞和基因間的同質(zhì)降解率，或在數(shù)代(細(xì)胞)間分子狀態(tài)的維持，這些假設(shè)在單基因水平上可能不成立。

在這里，作者引入了Live-seq，一種使用細(xì)胞質(zhì)活檢在轉(zhuǎn)錄組分析后保持細(xì)胞存活的技術(shù)。該方法是基于流體力顯微鏡(FluidFM)在單細(xì)胞水平下將力控制與體積控制耦合在一起。通過優(yōu)化FluidFM程序和低含量(low-input)的RNA測序(RNA-seq)方法和結(jié)合它們，我們發(fā)現(xiàn)高質(zhì)量的細(xì)胞質(zhì)mRNA可以從活的單細(xì)胞中提取，其數(shù)量與轉(zhuǎn)錄組分析相匹配。由于這一過程可以在保持細(xì)胞存活的情況下進(jìn)行，因此可以直接將細(xì)胞的當(dāng)前狀態(tài)與其下游分子和表型特性相結(jié)合。我們演示了Live-seq如何可以用于執(zhí)行相同細(xì)胞的順序分子分析。此外，我們發(fā)現(xiàn)Live-seq可以作為一個轉(zhuǎn)錄組記錄器，通過預(yù)先記錄單個巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，從而識別巨噬細(xì)胞脂多糖(LPS)響應(yīng)異質(zhì)性的基礎(chǔ)因素，揭示基礎(chǔ)Nfkbia表達(dá)水平和細(xì)胞周期狀態(tài)作為重要的表型決定因素。

我們簡單的介紹一下研究結(jié)果

首先，作者對單細(xì)胞活檢的方法做了以下優(yōu)化：

(1)減少提取時間，(2)降低溫度，(3)預(yù)加載帶采樣緩沖液的FluidFM探針，目的是立即將提取的細(xì)胞質(zhì)液與RNase抑制劑混合，從而最大限度地減少細(xì)胞到試管中轉(zhuǎn)移過程中樣本RNA的降解和(已經(jīng)是皮升量級的)樣本的丟失，(4)將提取液釋放到含有與下游RNA-seq兼容的緩沖液的微升液滴中;(5)實現(xiàn)基于圖像的細(xì)胞跟蹤以進(jìn)行順序提取。這些操作使得live-seq可以僅利用1pg的RNA建庫。

為了評估細(xì)胞質(zhì)mRNA活檢(live-seq)是否可以作為完整(裂解)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的合適代表，我們比較了Live-seq基因表達(dá)譜與使用全細(xì)胞Smart-seq2建庫獲得的基因表達(dá)譜矩陣。使用相同的細(xì)胞類型和處理組，我們用scRNA-seq對573個細(xì)胞進(jìn)行了測序，其中554個細(xì)胞通過了應(yīng)用于Live-seq樣本的相同過濾標(biāo)準(zhǔn)。與Live-seq相比，每個細(xì)胞的平均基因數(shù)更高:8,328個基因，每個細(xì)胞的測序深度約為70,000個reads。雖然live-seq的敏感性略低，但是live-seq對于細(xì)胞類型的鑒別即使在不去批次的情況下一致性也非常之高。相同細(xì)胞類型在兩種技術(shù)之間的表達(dá)矩陣也具有非常強(qiáng)烈的相關(guān)性。

最重要的是，live-seq并沒有改變這些細(xì)胞的生物學(xué)狀態(tài)、沒有誘導(dǎo)特定基因的表達(dá)：

那么作者就可以通過live-seq構(gòu)建連續(xù)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，

作者試圖建立一種連續(xù)Live-seq采樣方法，這將允許人們記錄細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變前后的分子特征。為此，作者考慮了一個快速和較慢的細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變模型:分別對細(xì)胞外刺激(LPS)的響應(yīng)和分化(脂肪形成)

對于前一個模型，第一次采樣24個RAW細(xì)胞，然后用LPS刺激它們，之后第二次采樣相同的細(xì)胞。此外，在兩個采樣事件之后，也用延時顯微鏡對各自的細(xì)胞進(jìn)行監(jiān)測。這些努力產(chǎn)生了4個連續(xù)的探針細(xì)胞，反映了通過轉(zhuǎn)錄組質(zhì)量控制截斷標(biāo)準(zhǔn)(方法)的樣本比例相對適中(每次提取約40%)。為了驗證各自的基因表達(dá)譜是否正確地顯示了從基礎(chǔ)狀態(tài)到lps刺激狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，作者將Live-seq序列采樣信息投影在圖2f、g所示的Live-seq和scRNA-seq綜合數(shù)據(jù)之上。最終發(fā)現(xiàn)，按順序采樣的細(xì)胞，每一個在相同的t分布隨機(jī)鄰居嵌入(t-SNE)圖中構(gòu)成兩個不同的點，正確地映射到各自的細(xì)胞狀態(tài)簇，提供了細(xì)胞軌跡的直接的、轉(zhuǎn)錄組范圍的讀取。

總之，作者多方面驗證自己live-seq的可靠性并通過闡明巨噬細(xì)胞受到LPS刺激的前后差異加以佐證，本推送只為做一個快訊，感興趣的同學(xué)可以詳細(xì)讀一下原文(Figure、extended Figure和supplemental Figure共幾十張)。