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干貨|菌(毒)種鑒定指導(dǎo)原則與鑒定方法

 閱微基因 2023-01-16 發(fā)布于北京

菌毒種

系指直接用于制造和檢定生物制品的細(xì)菌、真菌、支原體、放線菌、衣原體、立克次體或病毒等,包括各種經(jīng)過基因工程修飾的菌毒種。

——生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理及質(zhì)量控制《中國(guó)藥典》2020年版

菌毒種作為重要的實(shí)驗(yàn)材料被廣泛應(yīng)用于診斷試劑、藥物篩選、疫苗及生物制品研發(fā)等領(lǐng)域,其質(zhì)量直接影響科研及生產(chǎn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,若使用的菌毒種有誤或者存在污染,將對(duì)結(jié)果造成嚴(yán)重影響;因此,菌毒種資源所對(duì)應(yīng)的信息準(zhǔn)確、完整與否,亦是生物制品質(zhì)量審評(píng)的重要關(guān)卡。

《中國(guó)藥典》規(guī)定,生物制品生產(chǎn)用菌毒種應(yīng)采用種子批系統(tǒng),并應(yīng)盡量減少傳代次數(shù),以降低發(fā)生遺傳變異的風(fēng)險(xiǎn)。工作菌株的傳代次數(shù)應(yīng)嚴(yán)格控制,不得超過5代(從菌種保藏機(jī)構(gòu)獲得的標(biāo)準(zhǔn)菌株為第0代);原始種子應(yīng)驗(yàn)明其歷史、來(lái)源(包括重組工程菌毒種的構(gòu)建過程)和生物學(xué)特性。美國(guó)藥典(USP)部分標(biāo)準(zhǔn)要求從保藏機(jī)構(gòu)獲取的菌毒種傳代不能超過5代。美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)-M22-A3要求不能超過7代。

開展菌毒種質(zhì)量控制,對(duì)生產(chǎn)用菌毒種進(jìn)行生物學(xué)特性、生化特性、血清學(xué)試驗(yàn)和分子遺傳特性等的檢定,確保生產(chǎn)用菌毒種的檢定符合各論要求。

生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理及質(zhì)量控制《中國(guó)藥典》2020年版

以下主要介紹菌毒種鑒定中的分子生物學(xué)方法。

菌毒種鑒定

表型特征方法

表型微生物鑒定依據(jù)表型特征的表達(dá)來(lái)區(qū)別不同微生物間的差異,通過比較微生物的菌落形態(tài)、理化特征和特征化學(xué)成分與典型微生物的差異進(jìn)行鑒別。

表1 微生物分類中常用的表型特征

菌毒種鑒定

分子生物學(xué)方法

與表型特征不同,應(yīng)用分子生物學(xué)方法通常不受生長(zhǎng)培養(yǎng)基或分離物活性的影響,只需分離到純菌落便可用于分析。由于大部分微生物物種中核酸序列是高度保守的,所以16S rRNA核酸測(cè)序、18S rRNA核酸測(cè)序、ITS核酸測(cè)序和全基因組核酸測(cè)序等“系統(tǒng)發(fā)育結(jié)構(gòu)”鑒定方法理論上更值得信賴。

表2 微生物分類學(xué)的基因型/系統(tǒng)發(fā)育的特征

細(xì)菌16S rRNA基因序列和真菌的ITS核酸序列在結(jié)構(gòu)和功能上具有高度保守性,是微生物核酸測(cè)序鑒定和分類中廣泛應(yīng)用的DNA特征性核酸序列,方法易標(biāo)準(zhǔn)化,鑒定結(jié)果可以滿足一般菌種鑒定的要求。對(duì)16S rRNA(全長(zhǎng)約1500bp)和ITS(ITS1與ITS2)全長(zhǎng)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物后純化,純化產(chǎn)物使用sanger法進(jìn)行序列測(cè)定,然后與公用數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI)進(jìn)行比對(duì),進(jìn)行菌種鑒定。

不過16S rRNA等標(biāo)簽基因,一般能夠鑒定到種的級(jí)別,若是確認(rèn)同種中的兩個(gè)相同株需要比對(duì)更多的基因序列或特征基因片段,甚至是全基因組序列的比對(duì)來(lái)保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。


16S F端測(cè)序峰圖示例

16S R端測(cè)序峰圖示例

序列比對(duì)結(jié)果

全基因組核酸測(cè)序可以得到菌株核酸水平的全部遺傳信息,通過核酸序列的比對(duì)分析,進(jìn)行菌株的鑒定、功能挖掘及安全性評(píng)價(jià)等分析。2020 版《中國(guó)藥典》人用基因治療制品總論要求應(yīng)保證起始原材料的遺傳穩(wěn)定性,并基于細(xì)胞庫(kù)/種子批經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)或多次傳代后產(chǎn)物的完整性和一致性。在特定情況下因某些位點(diǎn)產(chǎn)生突變?cè)斐尚蛄信c理論不符,應(yīng)提供不影響目的基因表達(dá)和制品質(zhì)量的證據(jù)。全基因組核酸序列檢測(cè)方法對(duì)遺傳變異的分析能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)尚未導(dǎo)致表型改變、但核酸已發(fā)生變異的情況,從而進(jìn)行處置,避免因菌毒種變異而影響實(shí)驗(yàn)活動(dòng)。

食品和飼料安全基因組學(xué)跨機(jī)構(gòu)合作組織編寫的“Use of Whole Genome Sequencing by the Federal Interagency Collaboration for Genomics for Food and Feed Safety in the United States”描述了美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院、衛(wèi)生與公眾服務(wù)部、疾病控制和預(yù)防中心(CDC)和美國(guó)食品和藥物管理局(FDA),以及美國(guó)農(nóng)業(yè)部、食品安全和檢驗(yàn)局、農(nóng)業(yè)研究局和動(dòng)植物衛(wèi)生檢驗(yàn)局之間的食源性病原體分析、調(diào)查和協(xié)調(diào)工作。指出使用單核苷酸多態(tài)性(SNP)方法評(píng)估基因內(nèi)(編碼)和基因間(非編碼)的變異,根據(jù)廣義的法則與WGS數(shù)據(jù)比對(duì),≤20 SNPs 用于判定是否為同一菌株,且FDA在其GenomeTrakr nerwork中也是基于SNP的方法進(jìn)行菌株鑒定。

閱微基因菌毒種鑒定-全基因組測(cè)序方法,將待檢樣本與參考樣本比對(duì),統(tǒng)計(jì)兩者間SNP/突變位點(diǎn)數(shù)量并判定是否為同一株系(≤20 個(gè)SNP位點(diǎn)判定為同一株系來(lái)源,>20個(gè)SNP位點(diǎn)判定為非同一株系)。可接收樣本類型為核酸與菌種沉淀,病毒類樣本鑒定只接收核酸。

對(duì)SNP/突變位點(diǎn)的注釋,輔助判定突變是否會(huì)影響表達(dá)產(chǎn)物:

菌毒種的鑒定應(yīng)根據(jù)實(shí)際的需求以及所要達(dá)到的鑒定水平(屬、種、株),選擇最適合要求的鑒定技術(shù),必要時(shí)可采用多種鑒定方法進(jìn)行確認(rèn)。

質(zhì)量控制是產(chǎn)品安全、有效的重要保證和產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程中的重要環(huán)節(jié)之一,閱微基因可提供細(xì)胞特性、功能性、純度、安全性等分析,從藥典推薦方法到快速檢測(cè)方法滿足不同階段的研發(fā)需求,同時(shí)為研發(fā)型藥企及CXO企業(yè)提供從質(zhì)控、基因分析到臨床基因分型方法的驗(yàn)證開發(fā)。

閱微基因質(zhì)控檢測(cè)項(xiàng)目表

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[1] 2020 中國(guó)藥典

[2] 2021 基因修飾細(xì)胞治療產(chǎn)品非臨床研究與評(píng)價(jià)

[3] 2021國(guó)家干細(xì)胞轉(zhuǎn)化資源庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范

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[5] 《科學(xué)研究中規(guī)范使用病原微生物菌(毒)種專家共識(shí)》編寫組,國(guó)家病原微生物保藏中心/國(guó)家 病原微生物資源庫(kù). 科學(xué)研究中規(guī)范使用病原微生物菌(毒)種專家共識(shí)[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2022, 102(40): 3174-3180.

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[8] Whole Genome Sequencing (WGS) Program-FDA

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