DNA甲基化與癌癥之NGS檢測篇

劉得光3p6n6zqq 2021-12-16

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摘要

DNA甲基化是哺乳動物中研究最為深入的表觀遺傳修飾之一。正常細胞中，DNA 甲基化有效的調(diào)控基因表達水平。某些抑癌基因的失活是由于啟動子區(qū)域的高甲基化，大量實驗研究表明，在多種類型癌癥中，DNA甲基化導(dǎo)致了大范圍的基因沉默。除了啟動子區(qū)域和DNA重復(fù)序列中的甲基化水平改變外，甲基化還與非編碼RNA（如腫瘤抑制作用相關(guān)的microRNA）的表達調(diào)控有關(guān)。

DNA甲基化水平與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程的聯(lián)系，鼓勵著我們不斷的解碼人類表觀基因組。甲基化測序是研究不同生命過程中基因調(diào)控的一個重要工具，例如細胞分化和疾病進展，并且越來越多的應(yīng)用到包括腫瘤早篩、診斷等臨床檢測中。全基因組甲基化測序（WGBS）允許無偏好性的進行單堿基分辨率檢測，是理想的檢測目標(biāo)區(qū)域方法。當(dāng)您想進一步研究感興趣的目標(biāo)基因組區(qū)域，經(jīng)過雜交捕獲后再測序，這種有針對性的甲基化測序檢測方案成本更低。特別地，在評估具有低水平甲基化特征的復(fù)雜樣本時（如液體活檢中的游離DNA），一般需比常規(guī)全基因組甲基化測序達到更高的測序深度，雜交捕獲成為理想的實驗方案。

什么是甲基化

在哺乳動物細胞中，DNA甲基化的特征是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）的作用下，胞嘧啶嘧啶環(huán)（5-甲基胞嘧啶；5mC）第5位碳原子上添加上甲基基團（-CH3），并且甲基的共價加成通常發(fā)生在CpG二核苷酸中的胞嘧啶中（見下圖^[1]），該二核苷酸集中在稱為CpG島中，CpG位點成簇的以預(yù)期頻率出現(xiàn)。在人類基因組中，約有2800萬個CpG位點，約70%的正常體細胞中為甲基化，并且，這些CpG位點的分布并不均勻。大多數(shù)CpG島的長度為500-1000個堿基對（bp），他們通?？缭絾幼訁^(qū)域，特別是管家基因。與大部分基因組不同，位于CpG島內(nèi)的CpG位點通常在正常體細胞中為未甲基化狀態(tài)。

在哺乳動物中，負責(zé)5-甲基胞嘧啶（5mC）形成的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶包括DNMT1，DNMT3A及DNMT3B。DNMT1酶可以識別半甲基化的DNA，并保證維持現(xiàn)有的甲基化模式；DNMT3A和DNMT3B會在未甲基化的胞嘧啶上添加甲基基團。除了5-甲基胞嘧啶（5mC），5-羥甲基胞嘧啶（5hmc）為已發(fā)現(xiàn)胞嘧啶的甲基化中間產(chǎn)物，與5-甲基胞嘧啶（5mC）都為哺乳動物基因組中發(fā)現(xiàn)的兩種最常見的表觀遺傳標(biāo)記，通過雙加氧酶家族TET（包括TET1、TET2和TET3）蛋白，將5-甲基胞嘧啶（5mC）氧化為5-羥甲基胞嘧啶（5hmc）^[2]。DNA的5-甲基胞嘧啶(5mC)和5-羥甲基胞嘧啶（5hmc）水平，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。

甲基化與癌癥

DNA甲基化對于發(fā)育以及維持細胞正常功能至關(guān)重要，腫瘤細胞中甲基化特征與正常細胞大有不同，并且，在癌癥患者中可以同時檢測到低甲基化和高甲基化水平的改變。在腫瘤的發(fā)生的初始及進展階段，表觀水平就已經(jīng)出現(xiàn)了異常，DNA甲基化整體上發(fā)生了改變。一般而言，CpG區(qū)域的甲基化水平總體下降，可導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定性，但較少地激活沉默的原癌基因^[1]。

癌癥的發(fā)生、發(fā)展伴隨著DNA甲基化模式的改變，包括了逆轉(zhuǎn)錄元件、著絲粒及原癌基因的DNA低甲基化，以及與基因抑制相關(guān)的關(guān)鍵基因調(diào)控元件（如遠端增強子和啟動子轉(zhuǎn)錄起始的重疊區(qū)域）的甲基化。如下圖所示，在整個基因組的所有基因調(diào)控元件，正常細胞和癌癥細胞之間的DNA甲基化模式存在廣泛差異。正常基因組中的大部分CpG位點都攜帶著5mC，而遠端增強子元件及CpG島區(qū)域?qū)谆D(zhuǎn)移酶DNMT的活性具有抗性。癌細胞主要表現(xiàn)特征為整體范圍的失去甲基化遺傳學(xué)修飾，反而增強子和啟動子區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)異常的甲基化位點。這種甲基化分布的改變，導(dǎo)致了腫瘤抑癌基因的表達受抑制，并伴隨著原癌基因表達的增加，從而進一步推動了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。（在下圖中，白色圓圈代表未甲基化CpG位點；黑色圓圈代表甲基化CpG位點^[1]）。

DNA甲基化為常見的腫瘤標(biāo)志物

二十多年前，盧煜明教授等人已經(jīng)證明了利用DNA甲基化作為生物標(biāo)記物檢測孕婦/癌癥患者血漿中胎兒/腫瘤源性DNA的可行性^[3,4]。研究表明，在妊娠和癌癥模型中，cfDNA與其組織來源的基因組DNA之間的DNA甲基化特征高度一致。DNA甲基化在同一個體具有高度的組織特異性，同時，不同個體的相同組織，其甲基化水平可能也具有著一致性^[5]?？蓪⑦@一概念應(yīng)用于分析血漿樣本中的DNA甲基化水平，就可以推測cfDNA的組織起源。與檢測遺傳水平突變相比，表觀遺傳修飾在不同癌癥種類中具有更高的一致性。在臨床實踐中，可以從實體瘤或癌癥患者的血漿DNA中挖掘出具有臨床價值的DNA甲基化生物標(biāo)記物。Wanxia Gai等人總結(jié)了近些年利用此類DNA生物標(biāo)記物進行癌癥檢測的研究（見下表） ^[2]。

甲基化檢測應(yīng)用

提到甲基化在癌癥領(lǐng)域的應(yīng)用，最值得分享的便是長期專注于癌癥早診早篩的醫(yī)療公司GRAIL及將MRD用于早期結(jié)直腸癌患者的檢測和復(fù)發(fā)監(jiān)測的Guardant Health（GH）。

2020年6月，GRAIL在歐洲腫瘤學(xué)會（ESMO）旗下期刊《腫瘤學(xué)年鑒》（Annals of Oncology）發(fā)表了CCGA（Circulating Cell-free Genome Atlas，CCGA）的三個子項目實驗結(jié)果。在CCGA1的原理發(fā)現(xiàn)階段，使用訓(xùn)練集樣本1785例及驗證集樣本1015例，同時對三種不同的高通量測序（NGS）方案進行評估，包括了靶向測序、全基因組測序（拷貝數(shù)變異，CNV）及全基因組亞硫酸氫鹽測序（WGBS）。驗證結(jié)果證明，相比于DNA突變水平檢測，WGBS技術(shù)路線更適合應(yīng)用于癌癥早篩的研究領(lǐng)域^[6]。GRAIL也同時公布了其結(jié)合機器學(xué)習(xí)算法的cfDNA的甲基化測序分析技術(shù)可以同時檢測五十多種癌癥類型，其檢測的特異性>99%，并且對腫瘤信號組織來源的預(yù)測準確性>90%^[6]。由于CCGA是一項病例對照研究，可能無法真實的反映該血液檢測在普通人群篩查情況下的表現(xiàn)。目前，研究團隊仍在持續(xù)進行PATHFINDER實驗，通過納入更多的健康人群，以評估檢測方案在臨床護理環(huán)境中的實施及性能。

甲基化應(yīng)用的另一個方向為MRD（Minimal Residual Disease），即微小殘留病灶(是指癌癥治療后殘留在體內(nèi)的少量癌細胞（對治療無反應(yīng)或耐藥的癌細胞））。2021年4月，《臨床腫瘤研究》（Clinical Cancer Research）在線發(fā)表了名為《Minimal Residual Disease Detection using a Plasma-only Circulating Tumor DNA Assay in Patients with Colorectal Cancer》文章，Guardant Reveal首次公開了僅使用血漿ctDNA MRD的檢測數(shù)據(jù)，證明MRD檢測靈敏度達到91%，特異性達100%。Guardant Reveal的MRD技術(shù)路線是Tumor-agnostic策略，又稱為Tumor-uninformed，即僅依賴于血漿ctDNA進行MRD檢測（無需組織活檢），檢測方案為整合ctDNA突變（LOD為0.01％ctDNA）及ctDNA甲基化水平檢測（見下圖）。該研究表明，通過整合表觀基因組標(biāo)記，如DNA甲基化分析，比單獨基因組水平突變檢測靈敏度更高^[7]。

甲基化檢測之NGS方法及流程

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，NGS（Next-generation sequencing）也成為一種可快速獲得任何物種DNA甲基化圖譜的檢測方法。除了選擇全因組范圍內(nèi)的甲基化水平檢測外，還可以進行DNA富集后再測序，如MeDIP或MBD Cap（也稱為MeDIP-seq或MBD-Cap-seq）。甲基化DNA片段被特定的抗體或蛋白質(zhì)捕獲，經(jīng)過純化、擴增等步驟后測序。但該種檢測方案不能準確的識別單個位點的甲基化水平，常用于評估特定區(qū)域的甲基化水平。與之類似的為基于限制內(nèi)切酶的前處理方案，稱之為MSRE（MSRE-seq），使用甲基化位點敏感的限制性內(nèi)切酶（BstUI、HpaII、NotI和SmaI），針對非甲基化限制位點進行切割，同樣經(jīng)過純化、擴增等步驟后測序。由于以上兩種方法都具有較低的檢測分辨率和基因組覆蓋率，也就限制了在腫瘤領(lǐng)域，特別是癌癥早篩、早診的臨床應(yīng)用^[8]。

重亞硫酸氫鹽處理一直是繪制DNA甲基化圖譜的金標(biāo)準，由來自澳大利亞的Kanematsu等科學(xué)家開發(fā)的技術(shù)方案^[10，11]，DNA經(jīng)重亞硫酸氫鹽處理后，其胞嘧啶殘基轉(zhuǎn)化為尿嘧啶殘基，5-甲基胞嘧啶（5mC）則保持不變，各檢測方案對比見下表^[9]：

如果想針對大量樣本的特定區(qū)域進行甲基化檢測時，WGBS無疑成為一個成本相對較高的技術(shù)方案。幸運地是，雜交捕獲技術(shù)可以在一次反應(yīng)中檢測成千至上百萬個目標(biāo)基因組序列堿基，為此提供了一種性價比極高的解決方案，在成本允許的情況下可以實現(xiàn)更高的測序深度和更大規(guī)模的研究。

常規(guī)甲基化文庫制備方法為下圖中流程B所示，DNA在連接反應(yīng)步驟中加入測序接頭，轉(zhuǎn)化成可以上機測序的文庫后進行重鹽硫酸鹽處理，也稱作PreBS（Pre-Bisulfite）方法。該方案通常需至少微克量級別DNA，其主要原因是亞硫酸氫處理會破壞DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致測序時損傷的文庫無法進行簇生成。文庫序列信息或獨特分子的大量丟失，限制了供人類疾病研究的樣品類型，如游離核酸。即使低起始量DNA樣本最終轉(zhuǎn)化成可以上機的測序文庫，但由于重鹽硫酸鹽處理而導(dǎo)致極低的文庫分子復(fù)雜度，影響了最終的測序質(zhì)量，如產(chǎn)生較高的dup率。

為了解決上述遇到的難題，重亞硫酸氫鹽處理后進行建庫的技術(shù)方案逐漸成為主流的檢測路線，即PostBS （Post-Bisulfite），PBAT(Post Bisulfite Adapter Tagging)也屬于該方法之一（流程C）。PBAT是以重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后的單鏈DNA為初始模板，通過兩輪隨機引物延伸，從而連接兩端測序接頭。由于隨機引物的使用，使得：

重亞硫酸鹽處理后所產(chǎn)生的損傷DNA模版，其中有一定的比例無法結(jié)合引物，從而降低了測序文庫的分子復(fù)雜度；

隨機擴增有著模版偏好性。

值得注意的是，PBAT方案的改良版本也一直用于單細胞甲基化分析方案中。

Swift Biosciences（IDT埃德特公司收購）創(chuàng)立了更加優(yōu)化的建庫PostBS流程，與PBAT相同，都以重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后的單鏈DNA為初始模板；不同的是，IDT xGen? Methyl-Seq Library Prep（原來名稱Accel-NGS Methyl-Seq Library Kit，Adaptase技術(shù)）對重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化處理后的單鏈及損傷DNA進行最大程度地利用和轉(zhuǎn)化，從而提供更完整、偏好性更低的甲基化文庫（流程A）。

IDT xGen? Methyl-Seq Library Prep基于Adaptase^?專利技術(shù)，該技術(shù)是一種高效的、不依賴于模板的單鏈DNA接頭連接方法。該建庫試劑盒提高了文庫轉(zhuǎn)變效率，允許將重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化處理后的DNA樣品連接測序接頭，對樣本組成實現(xiàn)精準呈現(xiàn)。通過高效率的接頭連接方式，對重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化處理后的單鏈及損傷 DNA 進行文庫構(gòu)建，相比構(gòu)建文庫后再做亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化處理的方法，文庫產(chǎn)量可提升100倍；除此之外，使用IDT特有的、無偏好性的接頭連接方式，經(jīng)全基因組亞硫酸氫鹽測序（WGBS）驗證，xGen? Methyl-Seq Library Prep甲基化建庫試劑盒可提供更完整、更偏好性更低的NGS文庫。

來自新加坡南洋理工大學(xué)Li Zhou等人在Illumina NovaSeq和HiSeqX測序平臺上，系統(tǒng)的比較了三種PostBS文庫制備試劑盒性能，包括xGen? Methyl-Seq Library Prep, Illumina TruSeq DNA Methylation kit（PBAT）和QIAGEN QIAseq Methyl Library kit（PBAT）^[12]。實驗設(shè)計如下表所示，樣本1-4及樣本5-8分別為全血和白細胞亞群（樣本5和8：CD4+T細胞；樣本6和7：中性粒細胞）

該研究團隊評估了包括測序質(zhì)量（Q20, Q30, 低質(zhì)量堿基去除比例等）、文庫質(zhì)量（平均插入片段大小、重疊區(qū)域比例、dup率等）、覆蓋度（平均有效測序深度、覆蓋度均一性、CpG位點覆蓋情況）等測序指標(biāo)，下方熱點圖綜合了三種建庫制備方法的總體性能比較結(jié)果，其中“綠色”和“紅色”分別表示性能表現(xiàn)好及差的技術(shù)方法。如某一特定指標(biāo)兩兩比較時，在統(tǒng)計上沒有顯著差異，那么該兩種方法將被賦予平均表現(xiàn)的相同等級，例如，在評估Q20測序指標(biāo)時，IDT xGen? Methyl-Seq Library Prep和TruSeq都為最佳表現(xiàn)的試劑盒，且等級分數(shù)相同（2.5=（2+3）/2），因為兩者之間沒有統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異。

總結(jié)

甲基化測序是研究不同生命過程中基因調(diào)控的一個重要工具，例如細胞分化和疾病進展，并且越來越多的應(yīng)用到包括腫瘤早篩、分診、治療選擇、微小殘留監(jiān)測、復(fù)發(fā)檢測等臨床領(lǐng)域中。包括游離核酸在內(nèi)的體液樣本，含有來自于腫瘤的特異的DNA甲基化信號，作為生物標(biāo)志物樣本檢測來源，無疑是一個絕佳的選擇。

重亞硫酸氫鹽處理一直是繪制DNA甲基化圖譜的金標(biāo)準，由于其轉(zhuǎn)化效率的穩(wěn)定性，保證了后續(xù)甲基化檢測結(jié)果的準確性。在針對特定的目標(biāo)區(qū)域進行大樣本量的檢測時，WGBS就成為一個成本相對較高的技術(shù)方案。雜交捕獲技術(shù)，搭配PostBS單鏈建庫流程，可對感興趣的目標(biāo)區(qū)域進行精準研究。

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參考資料：

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