▎藥明康德內(nèi)容團隊編輯

近年來，細胞療法在治療癌癥方面表現(xiàn)出優(yōu)異的療效，目前已經(jīng)有5款CAR-T療法獲得美國FDA的批準，多種同種異體CAR-T療法，T細胞受體（TCR）-T細胞療法，以及腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）療法也在臨床試驗中獲得佳績。CRISPR基因編輯技術作為一種簡便有效的突破性基因編輯技術，問世以來，不但在基礎科學研究領域得到廣泛應用，在臨床應用方面也不斷獲得突破，無論是體外編輯還是體內(nèi)編輯都獲得可喜的臨床進展。

那么，將CRISPR基因編輯技術與抗癌細胞療法結合能夠碰撞出什么樣的火花？近日發(fā)布的一篇綜述描述了使用CRISPR基因編輯技術改良抗癌細胞療法的前景。

目前獲得批準的CAR-T療法都需要從患者體內(nèi)獲得T細胞，在體外進行改造和擴增，然后再輸回患者體內(nèi)。這種自體細胞療法的生產(chǎn)工藝耗時耗力，而且有些患者因為疾病進展速度快，或者無法提供足夠的健康T細胞而無法接受它們的治療。

解決這些局限的一個主要方向是開發(fā)基于健康供體提供的T細胞而生產(chǎn)的同種異體的“通用型”CAR-T細胞療法。這一策略可以提前進行細胞療法的生產(chǎn)，它們可以用于及時治療不同患者。然而，由于供體的T細胞表面表達著獨特的T細胞受體和人類白細胞抗原（HLA）。這一策略面臨的重大挑戰(zhàn)之一是患者的免疫排斥（患者免疫系統(tǒng)攻擊輸入的細胞療法）和移植物抗宿主?。ㄝ斎氲募毎煼ü艋颊叩慕】到M織）。

基因編輯提供了一種敲除供體T細胞的TCR和HLA的方法，而CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)因為其靈活性和高效的編輯能力，成為敲除TCR和HLA表達的有力工具。以往的臨床前實驗顯示，利用表達嵌合抗原受體（CAR）的慢病毒載體可以遞送多個指導RNA（guide RNA），同時敲除內(nèi)源性TCR和HLA-1等多個蛋白的表達。

▲利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)可以敲除內(nèi)源性TCR和HLA，生成“通用型”CAR-T細胞療法（圖片來源：參考資料[1]）

而且，使用CRISPR/Cas9技術還可以將表達CAR的序列特異性地插入到細胞的T細胞受體α恒定區(qū)（TRAC）的基因位點，帶來CAR的一致性表達。在體外和小鼠模型中，這種方法生成的CAR-T細胞與常規(guī)CAR-T細胞相比，表現(xiàn)出增強的抗癌活性。

困擾CAR-T療法療效持久性的另一個因素是T細胞耗竭和具有免疫抑制特征的腫瘤微環(huán)境。目前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種免疫檢查點蛋白能夠起到抑制T細胞活性或者促進T細胞耗竭的效果，包括PD-1， CTLA-4，LAG-3和TIM-3等等。因此，CRISPR基因編輯系統(tǒng)已經(jīng)在臨床前研究中被用來敲除這些免疫檢查點蛋白，旨在增強CAR-T細胞療法的抗癌活性和持久性。

在異種移植癌癥模型中，使用CRISPR基因編輯敲除PD-1表達，讓CAR-T細胞表現(xiàn)出更強的清除PD-L1陽性腫瘤的活性。

▲利用CRISPR基因編輯系統(tǒng)，可以敲除或敲低多種抑制CAR-T細胞療法活性的基因（圖片來源：參考資料[1]）

日前，由諾獎得主Jennifer Doudna教授聯(lián)合創(chuàng)建的Caribou Biosciences公司宣布，該公司利用CRISPR基因編輯敲除PD-1表達的同種異體CAR-T療法，已經(jīng)在治療復發(fā)/難治性B細胞非霍奇金淋巴瘤的1期臨床試驗中完成首例患者給藥。

雖然CAR-T療法在治療血液癌癥方面療效顯著，但是它們在治療實體瘤方面尚未表現(xiàn)出類似的顯著效果，缺乏在腫瘤細胞表面表達的特異性抗原靶點是限制CAR-T細胞在實體瘤領域應用的原因之一。而TCR-T細胞療法因為可以靶向腫瘤內(nèi)部表達的抗原，在治療實體瘤方面可能具有更好的前景。

TCR-T細胞療法的生成需要在T細胞上表達能夠與腫瘤細胞呈遞的抗原復合體結合的T細胞受體。阻礙TCR-T細胞療法的一個主要原因是T細胞內(nèi)源性TCR的表達。它們可能與轉基因TCR發(fā)生競爭，阻礙轉基因TCR的表達和與CD3受體的結合。內(nèi)源性TCR還可能與轉基因TCR形成異二聚體，影響它們與抗原復合體的結合。

CRISPR基因編輯系統(tǒng)可以敲除內(nèi)源性TCRα和β基因，并且將它們替換成腫瘤特異性TCR序列。這種基因編輯與其它技術結合，能夠幾乎100%地消除異二聚體的產(chǎn)生，從而改善TCR-T細胞療法的抗癌活性。

▲CRISPR基因編輯系統(tǒng)可以敲除內(nèi)源性TCRα和β基因，消除異二聚體的產(chǎn)生（圖片來源：參考資料[1]）

賓夕法尼亞大學Abramson癌癥中心的Stadtmauer教授團隊已經(jīng)在臨床試驗中證明，使用CRISPR技術可以成功敲除內(nèi)源性TCR，生成的靶向NY-ESO-1抗原的TCR-T細胞療法在３名患者中表現(xiàn)出良好的安全性。它們可以患者體內(nèi)擴增，并表現(xiàn)出對腫瘤的靶向性。

在治療實體瘤方面，腫瘤浸潤細胞（TIL）療法已經(jīng)在臨床試驗中表現(xiàn)出出色的療效。例如，Iovance Biotherapeutics開發(fā)的TIL療法在治療晚期宮頸癌、黑色素瘤和非小細胞肺癌患者時都顯示出可喜的緩解率和緩解持續(xù)時間。這種療法從患者的腫瘤組織中分離腫瘤浸潤細胞，在體外進行培養(yǎng)和擴增，然后輸回到患者體內(nèi)。

然而，它遇到的潛在問題是從腫瘤組織中獲得的TIL數(shù)目相對較少，需要在體外進行大幅度擴增。而大幅擴增的過程可能讓TIL進入分化狀態(tài)，當它們再被輸回到患者體內(nèi)后會更快地進入耗竭狀態(tài)，導致療法效果降低。

而通過CRISPR基因編輯，可以敲除TIL細胞中的免疫檢查點蛋白，讓TIL在體外擴增之后仍然保留分化程度較低的干細胞特征，從而延長TIL細胞療法的持久性。

明尼蘇達大學（University of Minnesota）的研究人員已經(jīng)啟動一項臨床試驗，將使用CRISPR基因編輯系統(tǒng)敲除TIL細胞中的檢查點基因CISH，在胃腸道癌癥患者中檢驗用這一方法擴增的TIL細胞療法的效果。

CRISPR基因編輯系統(tǒng)作為一種工具，能夠高特異性地編輯T細胞的基因組，這讓研發(fā)人員有機會對多個用藥物無法靶向的基因進行改造，從而從不同角度增強細胞療法的抗癌活性。而且，CRISPR基因編輯系統(tǒng)的另一項應用——CRISPR篩選，已經(jīng)被研發(fā)人員用來篩選能夠提高免疫療法療效的基因靶點。目前已經(jīng)有多項研究發(fā)現(xiàn)了新的T細胞激活調(diào)節(jié)因子，T細胞代謝調(diào)節(jié)因子，以及抗原處理/呈遞通路和干擾素通路中的創(chuàng)新靶點，為CRISPR基因編輯提供了更多的靶點。

“如今隨著CRISPR的進步，有太多基因可以被特異性靶向（來增強細胞療法的效果）。”德克薩斯大學MD安德森癌癥中心的干細胞移植和細胞療法教授Katy Rezvani博士在訪談中表示。

我們期待CRISPR基因編輯技術和T細胞療法的結合，未來為更多患者帶來更好的抗癌療法。