你是否也常常為 RNA 提取感到困惑,每次提取都在不斷接受各種挑戰(zhàn),例如 RNA 降解、低產(chǎn)率、低純度以及 DNA 污染等等。此外,還會(huì)遇到各種各樣的樣品,卻找不到一個(gè)普適的方法來(lái)解決。 今天,我們就給大家分享下 RNA 分離技巧,特別是最大限度地回收高質(zhì)量、無(wú) DNA 的 RNA 的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。 收集樣品后穩(wěn)定 RNA RNA 是不穩(wěn)定的,極易降解。許多樣品含有高水平的 RNase,會(huì)快速降解 RNA。為了使之最小化,最好在采集時(shí)穩(wěn)定樣本中的 RNA。常用的樣品穩(wěn)定方法包括液氮快速冷凍、干冰乙醇浴或 -80 °C 冷凍室。然而,這些方法也有缺點(diǎn),如核酸的凍融損傷。 最佳 RNA 穩(wěn)定方法:
確保樣品完全溶解 在 RNA 提取過(guò)程中,提高 RNA 產(chǎn)量和質(zhì)量的最佳方法是保證樣品完全裂解。然而,并不是所有的樣本都對(duì)相同的裂解方案敏感。例如,血細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞、PBMCs 等)和微生物細(xì)胞往往很難有效溶解,僅僅添加基于洗滌劑的裂解緩沖液可能并不夠。 為了提高裂解效果,可以將裂解緩沖液與機(jī)械裂解步驟(研磨珠破碎)匹配,或者在裂解液上游加入酶裂解步驟(如蛋白酶 K、溶菌酶等)(圖 1)。 DNA 的存在會(huì)使基于 UV/VIS 的定量方法(如 Nanodrop)發(fā)生偏差,從而人為地提高 RNA 的定量,使其高于實(shí)際水平。 此外,在更敏感的下游應(yīng)用(例如 RNA-seq)中,它還可能導(dǎo)致錯(cuò)誤讀數(shù)。這可以通過(guò)多種方法實(shí)現(xiàn)(例如 TRIzol? 相分離、DNA 去除柱和 DNase 處理)。 Zymo Research 開發(fā)了一種新型的 RNA 提取試劑盒,該試劑盒具有新的緩沖液和離心柱體系,可以結(jié)合和提取 RNA,同時(shí)消除污染的 DNA。RNA 分離試劑盒包括用于柱上處理的 DNase I。 這消除了提取后 DNA 酶處理和清理步驟的需要,并簡(jiǎn)化了從提取到下游應(yīng)用的過(guò)程。下面的圖 3 說(shuō)明了基于 PCR 缺乏 DNA 擴(kuò)增,ZYMO 柱對(duì) Dnase 處理是有效的。 針對(duì)不同類型樣本推薦的 RNA 產(chǎn)品: 本方法無(wú)需傳統(tǒng) TRIZOL 提取方法的相分離,而且不需要使用任何有毒有害的試劑(例如氯仿),7 分鐘就可完成整個(gè)操作步驟并且可以提取到含 microRNA 的總 RNA。 本表格針對(duì)各種樣品列出了參考用量,詳細(xì)用量請(qǐng)參見說(shuō)明書
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來(lái)自: 思想年代 > 《分子生物學(xué)》