自二十世紀(jì)八十年代以來，艾滋病造成了重大的公共衛(wèi)生問題和社會(huì)問題。目前全世界有超過3700萬人感染HIV病毒，據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)我國(guó)有150萬HIV感染者。

1996年，艾滋病領(lǐng)域研究取得了里程碑式進(jìn)展，HIV入侵T細(xì)胞的主要共受體CCR5蛋白被發(fā)現(xiàn)（鄧宏魁教授是主要發(fā)現(xiàn)者之一）。

隨后的研究發(fā)現(xiàn)，CCR5基因呈缺陷型（CCR5-Δ32）的人群不會(huì)被R5嗜性HIV病毒感染。2007年，一名同時(shí)患有白血病和艾滋病的“柏林病人”在接受具有CCR5-Δ32突變的造血干細(xì)胞移植后，血清中的HIV病毒得到有效清除，實(shí)現(xiàn)了艾滋病的“功能性治愈”，成為世界首個(gè)被治愈的艾滋病患者。

因此，通過基因編輯敲除成體造血干細(xì)胞上CCR5基因，再將編輯后的細(xì)胞移植到艾滋病患者體內(nèi)有可能成為“功能性治愈”艾滋病的新策略。

2019年9月11日，解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心陳虎研究組、北京大學(xué)鄧宏魁研究組、首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院吳昊研究組合作在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》（The New England Journal of Medicine）發(fā)表了題為：CRISPR-Edited Stem Cells in a Patient with HIV and Acute Lymphocytic Leukemia 的研究論文。

該臨床試驗(yàn)，利用CRISPR基因編輯技術(shù)，在人成體造血干細(xì)胞上進(jìn)行CCR5基因編輯，實(shí)現(xiàn)了經(jīng)基因編輯后的成體造血干細(xì)胞在人體內(nèi)長(zhǎng)期穩(wěn)定的造血系統(tǒng)重建。然后對(duì)一個(gè)患艾滋病和急性淋巴細(xì)胞白血病的27歲男性進(jìn)行治療。治療后病人的急性淋巴白血病達(dá)到形態(tài)上的完全緩解，病人的T細(xì)胞呈現(xiàn)一定程度上對(duì)HIV病毒的抵抗能力，且未發(fā)現(xiàn)脫靶效應(yīng)和副作用。

這項(xiàng)基因編輯是在成體造血干細(xì)胞上進(jìn)行的，因此并不會(huì)對(duì)其他組織器官及生殖系統(tǒng)產(chǎn)生影響。該工作初步證明了基因編輯的成體造血干細(xì)胞移植的可行性和在人體內(nèi)的安全性，將會(huì)促進(jìn)和推動(dòng)基因編輯技術(shù)在臨床應(yīng)用領(lǐng)域的發(fā)展。

如何在造血干細(xì)胞中進(jìn)行高效基因編輯一直是該領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)臨床應(yīng)用的關(guān)鍵瓶頸。2017年，鄧宏魁研究組建立了利用CRISPR/Cas9進(jìn)行人造血干細(xì)胞基因編輯的技術(shù)體系。經(jīng)過基因編輯后的人造血干細(xì)胞在動(dòng)物模型中長(zhǎng)期穩(wěn)定地重建人的造血系統(tǒng)，其產(chǎn)生的外周血細(xì)胞具有抵御HIV感染的能力，該研究成果發(fā)表在Molecular Therapy 雜志。

為了實(shí)現(xiàn)該技術(shù)在臨床上的應(yīng)用，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了一系列的優(yōu)化：

1）建立了能進(jìn)行基因編輯造血干細(xì)胞的預(yù)處理培養(yǎng)方法；

2）通過非病毒轉(zhuǎn)染的方式將Cas9-gRNA核糖核蛋白復(fù)合體遞送進(jìn)細(xì)胞，規(guī)避了外源DNA的引入；

3）縮短了Cas9在細(xì)胞內(nèi)的持續(xù)時(shí)間，從而極大的降低了脫靶效應(yīng)；

4）引入了配對(duì)的gRNA策略，并對(duì)使用的gRNA進(jìn)行了截短及修飾，在提高基因編輯效率的同時(shí)也降低脫靶效率。

基于此優(yōu)化技術(shù)體系，在通過原解放軍第307醫(yī)院倫理委員會(huì)審批后，該研究組進(jìn)行了ClinicalTrials.gov網(wǎng)站上臨床研究注冊(cè)（NCT03164135）。

該臨床試驗(yàn)的病人是一位27對(duì)男性，他在2016年5月14日和5月30日分別診斷患有艾滋病和急性淋巴細(xì)胞白血病（T細(xì)胞型）。隨后立即接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療，1年后HIV感染得到控制，在血清中檢測(cè)不到病毒RNA。病人接受6個(gè)療程標(biāo)準(zhǔn)的化療治療后，其形態(tài)上達(dá)到完全緩解。供體細(xì)胞來自中華骨髓供體庫的一名33歲男性，其HLA配型完全匹配，CCR5基因沒有突變。2017年7月9日，病人在清髓后，接受異體干細(xì)胞移植。干細(xì)胞移植的細(xì)胞由兩部分組成：動(dòng)員后外周血單核細(xì)胞分離出CD34+HSPCs，接受CRISPR編輯CCR5基因；剩下的單核細(xì)胞。病人同時(shí)接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療、移植物抗宿主病預(yù)防用藥。

移植治療后，13天和27天分別出現(xiàn)中性粒細(xì)胞和血小板重建；淋巴細(xì)胞和T細(xì)胞亞群增加，CD4細(xì)胞在6個(gè)月時(shí)恢復(fù)到正常范圍并穩(wěn)定；3個(gè)月時(shí)，血小板出現(xiàn)短暫減少，隨后自行恢復(fù)到正常范圍并穩(wěn)定；4周后，實(shí)現(xiàn)了完全的供體嵌合，并維持到了19個(gè)月。移植后4周，病人的急性淋巴白血病達(dá)到形態(tài)上的完全緩解，并維持到隨訪的19個(gè)月。

研究組將CCR5敲除后的供者來源的CD34+成體造血干細(xì)胞回輸?shù)交加邪籽『喜滩〉幕颊唧w內(nèi)，進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)兩年的移植重建及基因編輯效果的評(píng)價(jià)。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：

1）在供者來源的CD34+細(xì)胞上實(shí)現(xiàn)了17.8%的CCR5基因敲除效率；

2）移植后4周，患者白血病處于完全緩解狀態(tài)，供者型骨髓細(xì)胞嵌合率達(dá)100%；3）經(jīng)過長(zhǎng)達(dá)19個(gè)月的隨訪發(fā)現(xiàn)，患者白血病處于持續(xù)完全緩解狀態(tài)，供者型細(xì)胞完全嵌合，骨髓細(xì)胞中能夠持續(xù)檢測(cè)到CCR5基因編輯；

4）為了初步探索治療的有效性，對(duì)該患者短暫停止服用抗HIV病毒藥物。在短暫停藥期間，CCR5基因編輯的T細(xì)胞表現(xiàn)出一定程度抵御HIV感染的能力；

5）19個(gè)月的觀察中并未發(fā)現(xiàn)基因編輯造成的脫靶及其他副作用。

這些結(jié)果表明，基于CRISPR的成體造血干細(xì)胞基因編輯技術(shù)能夠在患者體內(nèi)實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定的基因編輯效果，經(jīng)過編輯后的成體造血干細(xì)胞能夠長(zhǎng)期重建人的造血系統(tǒng)。

在成體造血干細(xì)胞上的基因編輯只局限在造血干細(xì)胞及其分化產(chǎn)生的血細(xì)胞中，而不會(huì)對(duì)其他組織器官及生殖系統(tǒng)產(chǎn)生影響。以CRISPR為代表的基因編輯技術(shù)在疾病的治療上具有極大的應(yīng)用潛力，有望為艾滋病、鐮刀型貧血、血友病、β地中海貧血等血液系統(tǒng)相關(guān)疾病的治療帶來新的曙光。

本研究針對(duì)基因編輯安全性和有效性進(jìn)行了一系列的優(yōu)化，首次在人體內(nèi)探索了基因編輯的造血干細(xì)胞移植的可行性和安全性，對(duì)于推動(dòng)基因編輯技術(shù)治療多種疾病的臨床研究具有重要參考價(jià)值。在今后的研究中，進(jìn)一步提高基因編輯效率及優(yōu)化移植方案，有望加速基因編輯造血干細(xì)胞移植技術(shù)向臨床疾病治療轉(zhuǎn)化進(jìn)程。

該研究的共同通訊作者陳虎教授是中國(guó)造血干細(xì)胞領(lǐng)域的優(yōu)秀人物，在此研究中起到關(guān)鍵的作用，不幸的是陳虎教授在此論文修訂期間英年早逝。

陳虎教授（1962-2019），全軍造血干細(xì)胞移植中心主任、全軍造血干細(xì)胞研究所所長(zhǎng)、血液病專業(yè)委員會(huì)副主任，曾牽頭的“成體干細(xì)胞救治放射損傷新技術(shù)的建立與應(yīng)用”獲得國(guó)家科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)。

本文轉(zhuǎn)載自：北大生科