花生中最主要的一種病害是青枯病，是由青枯雷爾氏菌引起的。該病原菌通常感染植物的根部，然后通過(guò)維管束傳到地上部分。如果這些細(xì)菌繁殖到一定程度，植物就會(huì)出現(xiàn)萎蔫癥狀甚至死亡。青枯病是花生生產(chǎn)國(guó)中的毀滅性病害，在我國(guó)13個(gè)主要花生生產(chǎn)省份中已被發(fā)現(xiàn)，并可能造成高達(dá)50-100%的產(chǎn)量損失。通過(guò)選育具有穩(wěn)定抗性的花生品種是防治青枯病最有效的途徑。通過(guò)常規(guī)育種培育了幾十個(gè)抗病品種，并廣泛用于花生生產(chǎn)。它們的抗性在植物中是最穩(wěn)定和最持久的。

關(guān)于花生抗青枯病的遺傳機(jī)制目前了解得很少，通過(guò)了解控制性狀的遺傳機(jī)制，找到候選基因，可以開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記，用于基因組輔助育種，將極大地縮短育種時(shí)間，培育抗病品種。由于栽培花生(AABB，2n=4x=40)的A、B亞基因組具有很高的相似性，花生基因組大(~2.7Gb)，分子標(biāo)記多態(tài)性低，因此用傳統(tǒng)分子標(biāo)記覆蓋整個(gè)基因組具有挑戰(zhàn)性大、耗時(shí)和勞動(dòng)強(qiáng)度大等特點(diǎn)。因此需要更有效的策略快速定位抗青枯病的QTL，通過(guò)基因組輔助育種(GAB)，加快培育優(yōu)良品種進(jìn)程。

QTL-seq是一種結(jié)合了BSA及高通量測(cè)序的方法，能夠快速進(jìn)行QTL定位。該方法只需要對(duì)2個(gè)親本及2個(gè)子代混池進(jìn)行測(cè)序，具有高效、成本低的特點(diǎn)，已在豌豆、花生、鷹嘴豆等多種物種上得以應(yīng)用。本研究使用QTL-seq方法對(duì)花生青枯病抗性進(jìn)行了研究。

由抗病親本Yuanza9102(RP)與感病親本Xuzhou68-4(SP)構(gòu)建的RIL群體(含195個(gè)個(gè)體)。用收獲前的存活率評(píng)估其抗性。從中選取15個(gè)最低存活率的植株(2.15-11.54%)構(gòu)建感病混池SB；選取存活率最高的15個(gè)(92.96%-100%)構(gòu)建抗病混池。

對(duì)2個(gè)親本及2個(gè)混池的DNA分別構(gòu)建了~350bp文庫(kù)，采用Illumina NovaSeq 6000進(jìn)行測(cè)序，兩個(gè)親本SP、RP測(cè)序數(shù)據(jù)分別為82.25Gb、68.99Gb；兩個(gè)混池SB、RB的測(cè)序數(shù)據(jù)分別為111.7Gb、110.17Gb。

將兩個(gè)混池的reads比對(duì)到SP的參考序列，抗病、感病混池的覆蓋度為93.15%、93.04%；鑒定到164,522個(gè)SNPs；使用RP序列作為參考序列，抗病、感病混池的覆蓋度為93.09%，92.98%；得到243,380個(gè)SNPs。

使用鑒定到的SNP計(jì)算了SB、RB的SNP-index，并得到了ΔSNP-index。通過(guò)滑窗分析，將SNP-index顯著偏離0.5及ΔSNP-index顯著偏離0的區(qū)域定位為候選區(qū)域。

本研究使用SP序列作為參考序列，在B02染色體上定位到候選區(qū)間，長(zhǎng)度為3.35Mb(3.25-6.60Mb)；使用RP序列作為參考序列，定位到了2個(gè)候選區(qū)間，分別為B02上的3.25-6.90Mb區(qū)域及B09染色體上13.55-16.40Mb區(qū)間內(nèi)的2.85Mb。

為了驗(yàn)證并縮小B02上的候選區(qū)域，對(duì)28個(gè)ΔSNP-index較高的SNP開(kāi)發(fā)了KASP標(biāo)記，用這些標(biāo)記對(duì)RILs群體進(jìn)行基因分型并構(gòu)建了遺傳圖譜，圖譜長(zhǎng)度為38.14cm。并采用復(fù)合區(qū)間作圖法對(duì)3個(gè)環(huán)境下記錄的表型值進(jìn)行了QTL定位，LOD值在6.53-17.23，表型解釋率為14.4-29.32%；單標(biāo)記分析法也證明了3個(gè)標(biāo)記和青枯病抗性存在顯著關(guān)聯(lián)。因此，將B02上的候選區(qū)間縮小到了2.07Mb(3.74-5.81Mb)。對(duì)B09上的候選區(qū)間開(kāi)發(fā)了8個(gè)KASP標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證，構(gòu)建圖譜長(zhǎng)度為4.86cm；但復(fù)合區(qū)間作圖法及單標(biāo)記分析法都證明該區(qū)間沒(méi)有穩(wěn)定且主效QTL；結(jié)合之前基于SSR標(biāo)記研究鑒定到的5個(gè)QTLs,在B09上沒(méi)有鑒定到QTL，因此認(rèn)為B02上的2.07Mb區(qū)域含有抗青枯病的穩(wěn)定的主效QTL，且抗性等位位點(diǎn)來(lái)自于Yuanza9102。

圖1 花生中青枯病抗性鑒定的QTL-seq流程

在這2.07Mb區(qū)域中，有348個(gè)有效SNPs，其中246個(gè)是使用兩個(gè)親本做參考序列都能鑒定到的；76、26個(gè)分別是用其中一個(gè)親本做參考序列鑒定到的；有49個(gè)非同義突變SNPs，有19個(gè)候選基因。

在這19個(gè)發(fā)生非同義突變的基因中有7個(gè)能編碼NBS-LRR型的抗性蛋白，包括Araip.G1MIP, Araip.VE4DY, Araip.05JB8, Araip.YCN52, Araip.U0YME, Araip.WF303 和Araip.65IVT。

圖2 鑒定的與青枯病抗性有關(guān)的NBS-LRR抗性蛋白

用位于B02上2.07Mb基因組區(qū)域上的3個(gè)SNP標(biāo)記對(duì)21個(gè)抗病材料和9個(gè)感病材料進(jìn)行驗(yàn)證(材料由抗病品種Yuanza9102和感病品種Zhonghua5雜交得到)。有2個(gè)標(biāo)記(Araip_B02_3740746 和 Araip_B02_5804063)能夠?qū)⒖共〔牧虾透胁〔牧戏珠_(kāi)。標(biāo)記Araip_B02_3740746在抗病親本中擴(kuò)增出來(lái)CC等位基因型，在感病親本中擴(kuò)增出AA等位基因；第二個(gè)標(biāo)記Araip_B02_5804063在抗病親本中擴(kuò)增出GG等位基因型，在感病親本中擴(kuò)增出TT等位基因型。所有21個(gè)抗病材料都為CCGG基因型，而9個(gè)感病材料為AATT基因型。然后對(duì)由Yuanza9102與其它兩個(gè)抗病親本得到的2個(gè)抗病材料進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)他們都含有CCGG基因型；而對(duì)其它的13個(gè)感病材料和13個(gè)抗病材料進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)他們都擴(kuò)增出了AATT基因型。說(shuō)明來(lái)自于Yuanza9102的抗性等位基因可能與其它13個(gè)抗性材料的不同。

然后根據(jù)這兩個(gè)標(biāo)記將RILs群體分成了CCGG、AATT基因型的兩類，發(fā)現(xiàn)59個(gè)CCGG型的材料的平均存活率為74.45%，要顯著高于78個(gè)AATT型的(34.17%)。表明來(lái)自Yuanza9102的抗性等位基因能夠顯著提高花生青枯病抗性。通過(guò)上述研究，表明Araip_B02_3740746、Araip_B02_5804063這兩個(gè)標(biāo)記對(duì)于培育具有青枯病抗性的材料是有用的。

圖3 青枯病抗性診斷標(biāo)記的驗(yàn)證