最近發(fā)表在開放獲取期刊Genome Medicine 上的一項研究,報道了一種建立肝癌小鼠模型的新方法,即利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)快速將癌癥相關(guān)基因敲入小鼠的DNA中。 研究的通訊作者、麻省大學(xué)醫(yī)學(xué)院RNA療法研究所的王文說:“為了更好地理解腫瘤生物學(xué)、開展臨床前研究以及為病人找到潛在的治療策略,我們需要有效的腫瘤模型。現(xiàn)有用來敲入致癌基因以建立癌癥模型的方法或效率很低,或難以控制敲入位置和敲入的拷貝數(shù)。CRISPR/Cas9使得在基因組特定位置——我們將這種位置稱為目標(biāo)基因座——插入大片段DNA成為可能,并且可應(yīng)用于實驗室的人類細(xì)胞以及小鼠中。我們研發(fā)出了一個新的系統(tǒng)——CRISPR-SONIC,可以在肝癌小鼠模型中靈活進(jìn)行基因敲入,且準(zhǔn)確率很高?!?/p> 為了解決癌癥建模的現(xiàn)存問題、滿足快速有效建立動物模型的需求,牟海偉、Deniz Ozata和Jordan L. Smith研發(fā)了這一新系統(tǒng),利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)將致癌基因插入活小鼠的基因組。CRISPR/Cas9系統(tǒng)由一段向?qū)NA和Cas9酶組成。向?qū)NA是一種核苷酸短序列,它會附著到基因組中一個特定的目標(biāo)DNA序列上。由于向?qū)NA同時也與Cas9酶相連接,它可以將Cas9導(dǎo)向目標(biāo)DNA序列。然后Cas9會對DNA進(jìn)行剪切,移除單個核苷酸/整個基因,或在DNA修復(fù)過程中插入核苷酸/整個基因。 作者在本研究中使用了具有2個向?qū)NA的CRISPR/Cas9,進(jìn)行了一個三步驟的操作。首先,其中一個向?qū)NA和Cas9酶一起對目標(biāo)DNA位置進(jìn)行切割。第二步,另一個向?qū)NA和Cas9會對一個DNA環(huán)(即質(zhì)粒供體)進(jìn)行切割,第三步則是將已經(jīng)被切割成線狀的質(zhì)粒環(huán)插入目標(biāo)位置。 為了驗證這一方法,作者利用這種方法將一個綠色熒光蛋白(GFP)基因插入了實驗室培養(yǎng)的小鼠細(xì)胞中。這個基因在成功進(jìn)入細(xì)胞DNA后,會產(chǎn)生一種在激光下可見的綠色熒光蛋白,從而表明基因成功插入并被表達(dá)。在實驗室細(xì)胞中成功檢驗后,作者們在小鼠里測試了這種方法。 Deniz Ozata說:“我們觀察到在使用了CRISPR-SONIC后,我們的樣本中約有10%的肝臟細(xì)胞成功帶上了GFP。這相對于之前那些方法大約0.5%的敲入效率來說,是一個巨大的提升。” 隨后作者們對CRISPR-SONIC系統(tǒng)(包括向?qū)NA、Cas9酶以及一個致癌基因質(zhì)粒)進(jìn)行了測試,檢驗它是否可以用來為肝癌中發(fā)病率第二的肝內(nèi)膽管癌進(jìn)行小鼠建模。 牟海偉說:“導(dǎo)致這種癌癥的最常見基因突變發(fā)生在抑癌基因TP53(所有病例中約占26-44%)和致癌基因KRAS(所有病例中約占16-18%)中。過往研究顯示如果這兩個突變一起發(fā)生,可以在小鼠模型中引發(fā)肝內(nèi)膽管癌。我們用CRISPR-SONIC敲入了KRAS,同時加入另一個向?qū)NA敲除了抑癌基因TP53。這在癌癥建模中非常重要,因為在p53存在的情況下KRAS無法導(dǎo)致腫瘤的形成。” 將CRISPR-SONIC注射進(jìn)小鼠一個月后,作者觀察到小鼠肝臟中形成了腫瘤。對照組小鼠在注射了向?qū)NA、Cas9和一段發(fā)光DNA片段(而非致癌基因)之后,并未罹患腫瘤。 Jordan L. Smith說:“我們用RAS致癌基因檢測了我們的方法,但我們認(rèn)為任何致癌基因片段都可以用這種方法定制癌癥模型。我們展示了如何利用CRISPR-SONIC建立肝癌模型,但這種方法亦有應(yīng)用到其他組織和器官的潛力?!?/p> 作者還展示了這種方法亦可用于建立生物發(fā)光癌癥模型,這種模型可以讓研究者們實時監(jiān)測癌細(xì)胞的生長和癌癥發(fā)展。 Genome Medicine DOI: 10.1186/s13073-019-0627-9 Genome Medicine 掃描二維碼 訪問期刊主頁 Genome Medicine publishes research and reviews that describe important advances in the application of genetics, genomics and multi-omics to understand, diagnose and treat disease. Areas covered include, but are not limited to: precision medicine, novel methods and software, cancer genomics, disease genomics and epigenomics, immunogenomics, infectious disease, microbiome and systems medicine. Citation Impact 8.898 - 2-year IF 8.265 - 5-year IF 1.426 - SNIP 4.537 - SJR |
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