如果想知道細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子或染色質(zhì)重塑蛋白的結(jié)合序列信息，首先會想到染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP-Seq）技術(shù)【1】，然而ChIp-Seq技術(shù)對于細(xì)胞量要求較大，這樣才能得到超過噪音的有效富集信號。對于可培養(yǎng)的細(xì)胞來說這不是個問題，但對于比較難獲得的細(xì)胞如早期胚胎細(xì)胞，ChIP-seq技術(shù)有些力不從心，當(dāng)然不能否認(rèn)頡偉組、高紹榮組等曾經(jīng)利用ChIP-Seq技術(shù)分析了植入前胚胎的組蛋白修飾H3K4me3和H3K27me3的序列信息，收集細(xì)胞的難度以及該時期的重要性是該工作能發(fā)Nature的原因之一【2】。

新技術(shù)—CUT&RUN（cleavage under targets and release using nuclease，核酸酶靶向切割和釋放）的出現(xiàn)使得蛋白-DNA互作研究所需細(xì)胞量從ChIP-Seq的10,000降到100-1,000。2019年4月4日，發(fā)表在Cell期刊的Resource文章進(jìn)一步將該技術(shù)升級到單細(xì)胞水平，并應(yīng)用于早期胚胎。他們稱升級版的CUT&RUN 為超低量CUT&RUN（ultra-low input CUT&RUN, uliCUT&RUN）。文章的通訊作者是麻省大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Thomas G. Fazzio教授，共同通訊兼一作是其博后 Sarah J. Hainer，現(xiàn)任匹茲堡大學(xué)助理教授。

首先簡單介紹一下CUT&RUN技術(shù)，該技術(shù)由Henikoff 實驗室開發(fā)，與ChIP-seq相同點是使用抗體，具有特異性。不同點在于：ChIP-seq通常采取蛋白與DNA交聯(lián)，繼而利用超聲打斷DNA，這些步驟會產(chǎn)生背景噪音。CUT&RUN通過針對靶蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)重塑蛋白）的抗體和Protein A（特異結(jié)合免疫球蛋白G）的介導(dǎo)，使與Protein A融合的微球菌核酸酶（Micrococcal Nuclease，MNase）切割并釋放靶蛋白結(jié)合的序列，并進(jìn)一步建庫測序（Figure 1）【3，4】。

圖1． CUT&RUN原理圖

利用磁力珠結(jié)合細(xì)胞核，然后孵育靶蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子, TF）的抗體和Protein A-MNase，抗體和Protein A-MNase能夠通過核孔進(jìn)入細(xì)胞核，MNase （圖中蟹螯狀圖形）通過Protein A （六邊形） 和抗體的介導(dǎo)切割靶蛋白附近的序列，使用MNase好處在于可以控制酶切過程，因為MNase的活化需要Ca²⁺，可通過加入Ca²⁺或者其螯合劑來啟動和終止反應(yīng)，進(jìn)而將靶蛋白結(jié)合的序列從細(xì)胞核中釋放至上清中，用以建庫【3】。

本文對CUT&RUN技術(shù)的改進(jìn)包括：更換緩沖液、體系溶積、孵育時間、spike-in DNA量以及建庫制備和純化過程的改進(jìn)。

該課題組利用升級版的uliCUT&RUN技術(shù)首先在10-50萬細(xì)胞量的小鼠胚胎干細(xì)胞（mESCs）中研究CTCF和H3K4me3的序列結(jié)合信息。首先選用這兩個蛋白是因為它們在ChIP相關(guān)研究中展現(xiàn)很強(qiáng)的抗原表位。將利用該技術(shù)獲得的CTCF 或H3K4me3測序結(jié)果在這兩種蛋白已知結(jié)合位點處（來源于已有文獻(xiàn)ChIP-Seq數(shù)據(jù)）的read密度可視化，發(fā)現(xiàn)10細(xì)胞起始量的測序結(jié)果可以展現(xiàn)出類似50萬細(xì)胞量的結(jié)合位點富集熱圖。CTCF的結(jié)合區(qū)更為狹窄集中，而H3K4me3則占據(jù)相對寬的區(qū)段。而對照組（無抗體組）的熱圖則沒有這種特征 （圖2）。

圖2. 不同細(xì)胞量mESCs的uliCUT&RUN數(shù)據(jù)結(jié)果。CTCF（A）和H3K4me3 （B）的結(jié)合位點處read密度熱圖，橫向數(shù)字指示不同細(xì)胞量，縱軸是文獻(xiàn)報道的ChIP-Seq方法鑒定的結(jié)合區(qū)段（已知結(jié)合位點）。上下兩排分別是抗體組和無抗體組。

該方法的結(jié)合位點檢出率如何呢？以參考文獻(xiàn)中ChIP-Seq方法鑒定的結(jié)合位點數(shù)為參照，CTCF實驗組50細(xì)胞到50萬細(xì)胞量可以檢出57-99%的已知結(jié)合位點，10細(xì)胞量可以檢測出25-40%，H3K4me3實驗組檢出率稍微低一些，500及以上細(xì)胞量可以檢出42%-94%，10-50細(xì)胞量能夠檢出23-35%。盡管低細(xì)胞量的檢出率不高，但該方法的重復(fù)性很好，不同細(xì)胞量的數(shù)據(jù)有較高的交集。此外，該方法的特異性也比較高：例如已知的CTCF motif 或同源的CTCFL/BORIS motif 是在不同細(xì)胞量樣品中唯一找到的高顯示（over-represented）motif。

作者進(jìn)一步將此方法應(yīng)用到其他干細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子：OCT4、SOX2 和NANOG以及組蛋白修飾，他們發(fā)現(xiàn)50細(xì)胞量就可以獲得較高的檢出率。那么這種方法是否適用于單細(xì)胞么？與單細(xì)胞RNA-Seq（scRNA-Seq）比較，uliCUT&RUN 應(yīng)用于單細(xì)胞的難點在于一個細(xì)胞中蛋白結(jié)合DNA的拷貝數(shù)只能是2-4 (取決細(xì)胞所在的細(xì)胞周期) ，而單細(xì)胞中某些轉(zhuǎn)錄本mRNA的拷貝數(shù)可以達(dá)到上千級，所以在單細(xì)胞中應(yīng)用該技術(shù)所獲得檢出率并不高，50個單細(xì)胞uliCUT&RUN庫集中在一起可以檢出25%的已知CTCF結(jié)合位點。在應(yīng)用于單細(xì)胞的SOX2和NANOG uliCUT&RUN時， 能看到模糊但可辨的結(jié)合位點富集圖。同時，作者觀察到了單細(xì)胞SOX2和NANOG uliCUT&RUN數(shù)據(jù)圖中，在它們共同結(jié)合的Pou5f1 超級增強(qiáng)子區(qū)段內(nèi)有多處富集。提示盡管單細(xì)胞數(shù)據(jù)的覆蓋度不高，但這些因子的高結(jié)合率位點仍能夠被檢出，顯示其靈敏度。另外單細(xì)胞uliCUT&RUN的數(shù)據(jù)結(jié)果提示：TF結(jié)合位點處的read密度顯示了具有該TF-結(jié)合位點互作的細(xì)胞比率，只有部分TF結(jié)合位點在多數(shù)細(xì)胞中顯示被該TF占據(jù)。

uliCUT&RUN 技術(shù)的低細(xì)胞量要求和高靈敏度使早期胚胎細(xì)胞的蛋白-DNA互作研究變得簡單易行。利用該方法，作者發(fā)現(xiàn)了體內(nèi)環(huán)境下NANOG與其結(jié)合位點的互作依賴于SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合體家族成員esBAF的催化組分BRG1。在體外培養(yǎng)的mESCs 中，之前的研究發(fā)現(xiàn)BRG1敲減 后，NANOG對其結(jié)合位點的占據(jù)并無顯著變化【5】。然而體外與體內(nèi)環(huán)境畢竟不同，而BRG1和NANOG在發(fā)育過程中的表達(dá)次序提示二者可能有關(guān)聯(lián)。BRG1敲降后，30-50 細(xì)胞的早期囊胚uliCUT&RUN數(shù)據(jù)顯示NANOG對其結(jié)合位點的占據(jù)率明顯降低，而NANOG在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中的表達(dá)量未受影響，提示NANOG在與位點結(jié)合之前，需要BRG1打開染色質(zhì)復(fù)雜結(jié)構(gòu)。而這一結(jié)果體外培養(yǎng)的mESCs中并沒有看到【5】。

總之，uliCUT&RUN 技術(shù)將蛋白—DNA互作研究推進(jìn)到低細(xì)胞量乃至單細(xì)胞，仍有較高的靈敏度。這對較難獲得的細(xì)胞或組織（如早期胚胎）的研究是一大利好，利用該技術(shù)，研究人員在發(fā)現(xiàn)了多潛能性轉(zhuǎn)錄因子NANOG與其結(jié)合位點的互作依賴于SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合體組分BRG1。

原文鏈接：

https:///10.1016/j.cell.2019.03.014

制版人：珂

1. Johnson, DS; Mortazavi, A; et al. (2007). 'Genome-wide mapping of in vivo protein–DNA interactions'. Science, 316, 1497–1502.

2. Liu, X., Wang, C., Liu, W., Li, J., Li, C., Kou, X., Chen, J., Zhao, Y., Gao, H., Wang, H., et al. (2016). Distinct features of H3K4me3 and H3K27me3 chromatin domains in pre-implantation embryos. Nature. 537, 558–562.

3. Skene, P.J., and Henikoff, S. (2017). An efficient targeted nuclease strategy    for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife 6, e21856.

4. Skene, P.J., Henikoff, J.G., and Henikoff, S. (2018). Targeted in situ genomewide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nat. Protoc. 13, 1006–1019.

5. King, H.W., and Klose, R.J. (2017). The pioneer factor OCT4 requires the chromatin remodeller BRG1 to support gene regulatory element function in mouse embryonic stem cells. eLife 6, e22631.