組織樣本的單細(xì)胞制備

與貼壁或者懸浮細(xì)胞相比，組織樣本的單細(xì)胞制備相對(duì)有一定的難度和復(fù)雜性，也是同學(xué)們最容易出現(xiàn)問(wèn)題的地方，如細(xì)胞數(shù)量太少，細(xì)胞活性不好，細(xì)胞碎片太多等。下面就具體看看組織中的細(xì)胞如何制備。目前，最常用兩種方法是物理法和酶解消化法。 

組織樣本的處理方法

一、 物理方法：

• 原理：是指利用物理方法（機(jī)械法）分散組織，經(jīng)過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾獲得單細(xì)胞懸液。

• 應(yīng)用：常用于處理部分軟組織例如骨髓、胸腺、脾臟、淋巴結(jié)等，或富含細(xì)胞的腫瘤組織----淋巴肉瘤、視神經(jīng)母細(xì)胞瘤、腦瘤、未分化瘤、髓樣瘤以及一些軟組織肉瘤等，用單純的機(jī)械法就可以獲得大量高質(zhì)量的單分散細(xì)胞。

• 優(yōu)勢(shì)：操作方便，耗時(shí)短，且能獲得大量的細(xì)胞。

• 缺點(diǎn)：易造成組織細(xì)胞機(jī)械損傷，如細(xì)胞碎片和細(xì)胞團(tuán)塊，所以常與其他方法配合使用；對(duì)硬組織或纖維組織效果不好。

二、酶解消化法：

• 原理：利用酶（主要是膠原酶和蛋白酶）破壞組織間的膠原纖維、彈性纖維等、水解組織細(xì)胞的緊密連接結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)和粘多糖物質(zhì)以將實(shí)體組織分散為單個(gè)細(xì)胞的方法。

• 應(yīng)用：既可用于普通單層的傳代細(xì)胞也適合致密的組織樣本，如上皮、肝、腎等或含有大量結(jié)締組織的腫瘤----食管癌、乳腺癌、皮膚癌等。

• 優(yōu)勢(shì)：適用于大部分組織樣本獲取單細(xì)胞，酶的種類多選擇空間大。

• 缺點(diǎn)：操作步驟比較繁瑣，消化時(shí)間比較長(zhǎng)且難控制。不同的組織樣本酶種類、濃度、消化時(shí)間的選擇需要不斷摸索優(yōu)化。

下面具體介紹這2種方式的操作步驟：

1. 吹打：用移液槍或注射器反復(fù)吹打組織以獲得單個(gè)細(xì)胞的方法。應(yīng)用于：骨髓、腹腔、肺等組織中相對(duì)比較游離的細(xì)胞（骨髓、巨噬細(xì)胞等）。

實(shí)例分享：骨髓液?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞樣本制備

1. 處死小鼠，噴灑70%的乙醇溶液消毒，拉扯雙側(cè)后腿直至聽(tīng)到清脆的響聲（股骨從髖骨脫臼）；

2. 將皮膚和肌肉剝離，露出股骨和脛骨，取出后至于70%乙醇溶液中消毒；。

3. 眼科鑷夾住骨，無(wú)菌剪刀減掉骨兩端，吸取生理鹽水或PBS的注射器針頭插入骨髓腔，反復(fù)沖洗骨髓到15ml離心管中；

4. 如骨髓溶液中紅細(xì)胞較多，300g離心5min，棄上清，將室溫的裂解液（ACK buffer）3ml加入細(xì)胞沉淀，懸混室溫孵育3~5min；

5. 裂解后細(xì)胞懸液300g離心5min，棄掉上清；

6. 用細(xì)胞染色buffer或PBS重復(fù)洗1-2次；

7. 染色后、清洗、過(guò)濾，待上機(jī)檢測(cè)；

8. 如果需要骨髓組織里的淋巴細(xì)胞，請(qǐng)參照流式細(xì)胞術(shù)樣本制備（一）血液樣本淋巴細(xì)胞的制備方法

2. 剪碎研磨法：用鋒利的剪刀將組織剪碎后，并研磨以獲得單個(gè)細(xì)胞的方法。應(yīng)用于：脾臟、淋巴結(jié)、胰腺等新鮮組織。

實(shí)例分享：

1. 將組織用PBS或無(wú)血清培養(yǎng)基漂洗干凈；

2. 將組織置于平皿中，用眼科剪剪成小顆粒（1~2mm³）；

3. 用注射器針芯或載玻片磨砂面研磨成勻漿；

4. 滴加適量的PBS或無(wú)血清培養(yǎng)基，用移液器吹打混勻；

5. 經(jīng)100目細(xì)胞濾網(wǎng)過(guò)濾，300g離心5min，棄上清；

6. 用細(xì)胞染色buffer（或含0.1%BSA的PBS）離心洗滌1~2次。

3. 網(wǎng)搓法：用100-300目的尼龍濾網(wǎng)固定于燒杯口，組織在網(wǎng)上輕搓，可用此法獲得單個(gè)細(xì)胞的方法。常應(yīng)用于：正常的組織、瘤組織、淋巴結(jié)等標(biāo)本。

實(shí)例分享：

1. 將300目尼龍網(wǎng)扎在小燒杯上；

2. 把剪碎的組織放在網(wǎng)上，鑷子固定并輕搓組織塊，邊搓邊加PBS沖洗，直至將組織搓完；

3. 收集細(xì)胞懸液，300g離心5min，棄上清；

4. 用PBS等buffer離心洗滌1~2次。

1. 胰蛋白酶消化法：適用于消化間質(zhì)較少的組織，如上皮、肝、腎等組織。

實(shí)例分享：

1. 將組織塊用無(wú)鈣、鎂離子的PBS漂洗干凈；

2. 將組織置于培養(yǎng)皿中，用剪刀剪成小顆粒（1~2mm³）；

3. 加入30倍組織量的酶溶液（0.1%胰蛋白酶和0.02%EDTA等比混合）；

4. 移液管轉(zhuǎn)至50ml離心管中，置于37℃水浴或者恒溫箱搖床中，消化20-60min；若需消化較長(zhǎng)時(shí)間，可每隔15min將2/3的消化上清液轉(zhuǎn)移到離心管中冰浴或離心去除消化液，加入含血清培養(yǎng)基終止消化，另補(bǔ)充新的消化液至離心管中繼續(xù)消化；

5. 將消化液或分批收集的細(xì)胞懸液經(jīng)100目的濾網(wǎng)過(guò)濾，300g離心5min，棄上清；

6. PBS等buffer離心洗滌1~2次；

7. 染色，過(guò)濾準(zhǔn)備上機(jī)檢測(cè)。

2. 膠原蛋白酶消化法：此法適用于分離纖維性組織、上皮及癌組織，即纖維多的硬組織。鈣、鎂離子不會(huì)抑制消化作用，因此可用PBS或含血清培養(yǎng)基配制以提高細(xì)胞成活率。

實(shí)例分享：

1. 將組織塊用PBS漂洗干凈；

2. 置于培養(yǎng)皿中，剪成小顆粒（1~2mm³）；

3. 加入30倍組織量的蛋白酶溶液（0.1~0.3μg/ml的膠原蛋白酶）；

4. 移液管轉(zhuǎn)至50ml離心管，置于37℃水浴或者恒溫?fù)u床中消化3-48h，后續(xù)過(guò)程具體方法同胰酶消化法。

例如：肝癌組織單個(gè)核細(xì)胞樣本制備

1) 取實(shí)體腫瘤組織新鮮標(biāo)本，迅速在無(wú)菌條件下放入RPMI-1640培養(yǎng)基中；

2) 去除壞死及脂肪組織，選取癌細(xì)胞集中和細(xì)胞活力較好的部位；

3) 用鋒利的剪刀充分剪碎1-2mm³，將腫瘤組織轉(zhuǎn)移至15-50ml的離心管中；

4) 看組織體積加入5-6倍的酶解液，37℃搖床消化30-120min左右，（如果用水浴鍋消化，每隔5min就拿出來(lái)用吸管吹打一下使細(xì)胞分離）；

5) 加入等量的含血清的培養(yǎng)基終止消化，用槍頭反復(fù)吹打以獲得單細(xì)胞懸液，過(guò)100目濾網(wǎng)過(guò)濾，去除剩余殘?jiān)?，收集濾液，300g離心5min。

TIPs：

• 新鮮組織標(biāo)本應(yīng)及時(shí)進(jìn)行處理保存，以免組織在室溫下放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（24h內(nèi)），產(chǎn)生中心組織壞死或者細(xì)胞自融，影響FACS測(cè)定結(jié)果；

• 不同的實(shí)體組織應(yīng)選取不同的制備方法；

• 酶學(xué)法要注意條件的選擇和影響因素，同時(shí)注意酶的溶劑、消化時(shí)間、pH值、濃度等方法對(duì)酶消化法的影響；如消化時(shí)間太短細(xì)胞消化不完全，消化太長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生損傷；

• 如何判斷消化成功？如發(fā)現(xiàn)組織塊已分散而失去塊狀，經(jīng)搖動(dòng)可成為絮狀懸液，可取出少量液體在顯微鏡下觀察，可見(jiàn)分散的單個(gè)細(xì)胞和少量的細(xì)胞團(tuán)，可認(rèn)為消化充分。

• 在使用酶學(xué)方法時(shí)，應(yīng)重視酶的選擇，如含有大量結(jié)締組織的腫瘤----食管癌、乳腺癌、皮膚癌等，應(yīng)選用膠原酶消化。

為了使大家對(duì)酶消化法理解更加透徹，特奉獻(xiàn)上實(shí)驗(yàn)室的博士師兄師姐在樣本制備中的protocol供大家參考：

1. 腸干細(xì)胞的樣本制備（來(lái)自魏改改博士）:

1. 安樂(lè)死處死小鼠，取約5cm小鼠的小腸，縱向剖開(kāi)后冷PBS洗凈，平鋪組織用蓋玻片輕輕刮掉絨毛。

2. 將洗凈的小腸剪成3-5mm的碎塊，轉(zhuǎn)移至50ml無(wú)菌離心管內(nèi)，加入15ml濃度為5mM預(yù)冷的EDTA，4度（或冰上）消化20-30min。

3. 去掉EDTA上清，換成預(yù)冷的PBS，用移液槍持續(xù)吹打沉淀混合液并及時(shí)鏡檢，直至視野中出現(xiàn)大量小腸隱窩，靜止1分鐘左右，開(kāi)始收集上清。

4. 上清用70μM細(xì)胞濾篩過(guò)濾，重復(fù)收集上清3次后，800rpm，4度離心5分鐘收集沉淀。

5. 預(yù)冷的PBS重懸沉淀，600rpm離心，收集沉淀中含大量的隱窩。

6. 1000U/mlDNA酶及1mg/ml的胰酶37度消化30min。

7. 1200rpm/min離心5分鐘后，PBS重懸細(xì)胞。

8. 1-2μg/ml的碘化丙啶染色5min。

9. 流式分析GFP綠色熒光細(xì)胞所占比例，死亡細(xì)胞通過(guò)碘化丙啶去除。

2. 皮膚表皮干細(xì)胞樣本的制備(來(lái)自夏偉麗博士)：

1. 用手術(shù)鑷、剪切取適量的皮膚組織，去除皮下脂肪組織，并用無(wú)菌PBS清洗。

2. 真皮朝下，將皮膚展于0.25%的分離酶中，4度消化過(guò)夜。

3. PBS清洗多余分離酶，用手術(shù)鑷小心撕下表皮。

4. 0.25%的胰酶37度消化30min。

5. 無(wú)鈣血清終止消化，1000r/min離心10min。

6. 棄上清，并用PBS重懸沉淀，1000r/min離心清洗兩次，每次5min（若雜質(zhì)太多，可用40μm濾膜進(jìn)行過(guò)濾）。

7. 最后100μl PBS重懸，并用相應(yīng)的熒光素標(biāo)記抗體對(duì)表皮干細(xì)胞進(jìn)行冰上避光，孵育標(biāo)記30分鐘，并設(shè)置相應(yīng)的空白對(duì)照組、單染組和樣品組。

8. 用PBS進(jìn)行清洗，1000r/min離心兩次，每次5min。

9. 300μl PBS重懸過(guò)濾，流式上機(jī)檢測(cè)。

石蠟包埋組織的流式細(xì)胞樣本制備：

外科手術(shù)獲得的實(shí)體組織，大部分經(jīng)過(guò)石蠟包埋處理。石蠟包埋組織單細(xì)胞分散方法的建立，擴(kuò)大了流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用范圍。

1. 將石蠟包埋組織切成40~50μm厚的組織切片3~5片，或者用乳缽研成0.5mm直徑大小的顆粒，放入10ml的試管中；

2. 加入5~8ml二甲苯，室溫下脫蠟1~2天，視石蠟脫凈與否，更換1~2次二甲苯，石蠟脫凈后，棄去二甲苯；

3. 水化：依次加入5ml 的100%、95%、70%、50%梯度乙醇，每次10min；

4. 去乙醇，加入蒸餾水3~5ml，10min后棄之；

5. 消化：可加入2ml的0.5%胰蛋白酶（pH1.5~2.0）消化液，置于37℃恒溫水浴中消化30min，在此期間，每隔10min用振蕩器振蕩1次；

6. 消化30min后，加入含血清培養(yǎng)基終止消化；

7. 經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，未消化好的組織可進(jìn)行第二次消化；

8. 收集細(xì)胞懸液，300g離心5min，棄上清。

上一期我們?cè)敿?xì)介紹了流式操作中血液樣本的制備，本期則主要圍繞不同的組織樣本（新鮮腫瘤組織，石蠟包埋組織及其他正常組織如皮膚，小腸等原代細(xì)胞）的制備，相信大家都有了很清晰的認(rèn)識(shí)。有任何問(wèn)題，歡迎參與下方群聊，參與討論。