環(huán)狀RNA廣泛存在不同的腫瘤中，目前高通量測序及計算方法，主要針對環(huán)狀RNA的環(huán)化拼接位點進(jìn)行鑒定，很難確定環(huán)狀RNA內(nèi)部的外顯子和內(nèi)含子序列剪切方式及組成，所以對環(huán)狀RNA的內(nèi)部結(jié)構(gòu)難以明確。這將導(dǎo)致一些腫瘤特異性的circRNA可變剪切體（CIRC-AS）被忽略。武漢大學(xué)的何春江教授團(tuán)隊近日開發(fā)了一種新的算法——circSplice，可以特異性地識別circRNA內(nèi)部可變剪切事件，并比較多樣本組間circRNA可變剪切體差異（之前沒有工具可實現(xiàn)circRNA可變剪切體組間差異比較）。該研究作者進(jìn)一步在透明細(xì)胞腎癌和膀胱癌測序數(shù)據(jù)中利用circSplice分別檢測到4498和2977個circRNA可變剪切體，后續(xù)RT-PCR實驗結(jié)果也證實了circRNA可變剪切體的存在，進(jìn)一步對circRNA可變剪切體的生物功能進(jìn)行富集分析發(fā)現(xiàn)，癌癥特異性CIRC-As的不同模式存在潛在重要功能，對多種腫瘤特異性環(huán)狀RNA亞型的調(diào)控和功能研究具有重要意義。

目前，關(guān)于circRNA可變剪切體的研究還很匱乏，尤其是circRNA可變剪切體跟生物學(xué)功能或疾病特征關(guān)聯(lián)的研究更少，因此何教授這一全新成果為探索circRNA可變剪切體的功能研究提供了非常便利的工具，下面我們一起來了解下circSplice算法的工作原理和運(yùn)行機(jī)制。

CircSplice是一種比較多樣本間circRNA可變剪切（circ-AS）的新算法。CircSplice可以檢測反向剪切read（BSJ）及其配對read中的4種AS類型，包括外顯子跳躍（SE）、內(nèi)含子保留（RI）、選擇性5'剪切（A5SS）、選擇性3'剪切（A3SS），預(yù)測過程充分考慮了GT-AG/CT-AC原則，同時獨創(chuàng)性的支持不同樣本間circ-AS的比較，比如，用戶可以在癌和癌旁中檢測癌癥特異的circ-AS。CircSplice使用Perl編寫，并且在Unix以及Mac OS X中進(jìn)行了測試，在128GB內(nèi)存和2.2GB CPU的機(jī)器上運(yùn)行一個12G的樣本僅需要10分鐘。

一．CircSplice檢測circ-AS示意圖

二．CircSplice 工作流程：

1、通過STAR比對至參考基因組序列，得到chimeric reads。

2、保留那些比對上同一染色體和鏈的chimeric reads，通過CIGAR值判斷reads的坐標(biāo)。

3、識別BSJ，去除另一端落在供體和受體位點之外的reads，以確保另一端也來自circRNA。

4、通過剪切位點GT-AG或者CT-AC對BSJ進(jìn)行過濾和識別。

5、對BSJ進(jìn)行基因注釋。

6、將BSJ和其另一端reads比對到基因的外顯子或內(nèi)含子，結(jié)合基因注釋進(jìn)行4種剪切類型的判斷。允許2bp容錯。另外要求代表剪切的read的junction一端坐標(biāo)與注釋外顯子的一端坐標(biāo)一致，以減少假陽性預(yù)測。

7、通過GT-AG或CT-AC原則對可變剪切事件進(jìn)行過濾。

8、計算可變剪接事件的reads數(shù)，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（支持可變剪切的reads數(shù)*106/總chimeric reads數(shù)）。

9、根據(jù)坐標(biāo)融合不同樣本的剪切事件，比較樣本間的環(huán)狀RNA剪切事件。允許2bp容錯。

Circsplice是開源工具可以從http://gb./CircSplice 或

https://github.com/GeneFeng/CircSplice 獲取，網(wǎng)頁提供了詳細(xì)的介紹。

Feng J , Chen K , Dong X , et al. Genome-wide identification of cancer-specific alternative splicing in circRNA[J]. Molecular Cancer, 2019, 18(1):35.