果子導(dǎo)讀

這篇帖子本來應(yīng)該是大年初一發(fā)的的，但是我給忘記了。今天補(bǔ)上。
看到豆子今天的帖子和感想，能有這樣優(yōu)秀的伙伴在身邊是一種幸運(yùn)。提蛋白只是一個(gè)簡單的操作，但是豆子老師連講了5期，這只是她技能的一個(gè)小點(diǎn)，還有一大批帖子等著我們，這一年，有高師姐和豆子老師在，我自己很期待。
本來還想講幾句，但是此刻心里翻江倒海，五味雜陳，不知道如何開口。醫(yī)院前門的包子鋪沒有開，導(dǎo)致我?guī)滋鞗]有吃早飯，后門沒有什么餐館開門，中午就像游魂一樣找吃的，昨天開始消毒細(xì)胞培養(yǎng)箱，整個(gè)過程需要兩天。
過年會給連續(xù)的工作帶來打擊，工作的停頓從放假前3天就開始，一直持續(xù)到放假后3天，加起來都要兩周，而那種因?yàn)榉偶俣Ｏ聛淼臒崆?，不知道要什么時(shí)候才能完全恢復(fù)，老家還有一句話，正月里面都是年。

以下是今天豆子老師的正文：

最近看了很多場的團(tuán)拜會的表演，覺得好像有種說不出的感覺，但恍惚中星星點(diǎn)點(diǎn)仿佛照亮了什么，自己好像是舞蹈隊(duì)的隊(duì)長，一場下來有時(shí)候會表演四五個(gè)節(jié)目，自己好像愛好唱歌，音樂老師都說挺好的（可能只是鼓勵，反正我把他當(dāng)真了），自己能吹豎笛還是滿分，鼓樂隊(duì)的都特別想要我，但是還是被舞蹈隊(duì)打敗了，O(∩_∩)O~，自己仿佛朗誦的也不錯(cuò)，脫稿演講也有那么多次，自己或許文章寫的還可以，還上過報(bào)紙。。。

原來竟是勾起了自己塵封多年的記憶。我們有不同的自己，可以高山流水，陽春白雪，可以喜歡李煜潛來珠簾動，驚覺銀屏夢，可以有長江東去浪淘盡的魄力，可以有潤物細(xì)無聲的溫柔，有惟吾德馨的高雅，平平凡凡也是不錯(cuò)。不管做何種選擇，自己一定是舒服的開心的就好，所以我看到很多人說好像自己忘記了很多東西，我覺得其實(shí)并不是忘記了，只是沒有一個(gè)契機(jī)讓自己想起來，你的記憶就放在那里等你去取，但是放在哪里卻需要自己去找。

今天講講線粒體蛋白的提取

線粒體的重要性我想大家肯定都知道，線粒體主要是提供細(xì)胞內(nèi)各種物質(zhì)代謝所需要的能量。能量是我們進(jìn)行一切事情的前提條件，想要研究線粒體的功能以及物理化學(xué)性質(zhì)，提取線粒體必不可少，線粒體大量存在于代謝旺盛的細(xì)胞中，如動物的心肌，腦，肝，腎等器官和組織的細(xì)胞中，今天也是照舊提到幾種方法。

總的來說提取線粒體的過程大概是先破碎細(xì)胞保存線粒體的活性，再梯度離心分離線粒體，最后破碎線粒體，提取線粒體蛋白。

為保證獲得完整的線粒體，務(wù)必做到：第一，全程低溫操作；第二，快速；第三，在不破壞亞細(xì)胞器的情況下破碎細(xì)胞，這是制備線粒體的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

• 1.細(xì)胞(至少2 ×10^7個(gè)，最少一個(gè)10cm的dish，最好至少用兩個(gè))PBS洗3次。

• 2.收集細(xì)胞，先將細(xì)胞用PBS收集，再離心，棄掉PBS。

• 3.收集沉淀,用1ml 2mM HEPES勻漿，須在冰上操作，研磨30-40次。

• 4.4℃,800g離心10 min,收集上清于一新EP管中。

• 5.將上清以4℃, 11,000g離心15 min,將得到的沉淀用RIPA緩沖液洗滌并重懸,放于冰上15 min, 4 ℃, 10,000g離心10 min,收集上清即為線粒體蛋白

BSA的作用是為了去處內(nèi)生的游離脂肪酸，甘露醇和蔗糖是為了建立一定的滲透壓。

組織線粒體的提取(以腦組織為例)

A液:甘露醇0.3mol/L，EDTA 0.1mmol/L，PH=7.4，使用前加無脂肪酸的BSA 1g/L

• 1.取新鮮腦組織，PBS沖洗，洗凈血水，冰浴中剪碎，加入A液，勻漿，組織研磨20次。

• 2.將組織勻漿物轉(zhuǎn)移到離心管，4℃，3000rpm離心10 min，棄去沉淀。

• 3.取上清，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，4℃，10,000rpm再次離心10 min，留取沉淀即為腦線粒體。

還有一種提取組織線粒體的方法，但是需要用低溫超高速離心機(jī)，如果有的話可以可以選擇。

組織線粒體提取2：

A液：0.32mol/L蔗糖、10mmol/L EGTA、50mmol/L Tris-HCl,PH=7.4
B液：0.32mol/L 蔗糠、50mmol/L Tris-HCl,PH=7.4

• 取組織如前，加入A液勻漿，1000g離心10 min，

• 取上清液17,000g離心20 min，沉淀置于B液中，

• 在質(zhì)量濃度為75g/L，120g/L 聚蔗糖組成的不同密度梯度上，以68,000g離心1 h，其沉淀物即為線粒體，

• 置于B液中存于-80℃。

試劑盒提取線粒體：（SM0020）

組份：

• Lysis Buffer

• Mito-Wash Buffer

• Store Buffer

• 1. 樣本處理
  a. 組織勻漿：稱取100-200mg新鮮組織腦組織，PBS沖洗3次，洗凈血水，濾紙吸干，用剪刀剪為碎塊放入小容量玻璃勻漿器內(nèi)。加入1.0ml冰預(yù)冷的Lysis Buffer，0℃冰浴上下研磨組織20次；
  b. 培養(yǎng)細(xì)胞勻漿：PBS 洗滌，800g 離心10 min收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)。每次提取需要5×107（至少2盤10cm dish是細(xì)胞）個(gè)細(xì)胞，加入1.0 ml冰預(yù)冷的Lysis Buffer 重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到小容量玻璃勻漿器內(nèi)，0℃冰浴研磨30-40次

（與組織塊相比，培養(yǎng)細(xì)胞特別是貼壁培養(yǎng)細(xì)胞在用玻璃勻漿器勻漿時(shí)較難破壁，因而要選用小容量玻璃勻漿器、間隙嚴(yán)密的研杵上下研磨培養(yǎng)細(xì)胞）。

• 2. 將組織或細(xì)胞勻漿物轉(zhuǎn)移到離心管，4℃，1000g離心5 min。

• 3. 取上清，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，4℃，1000g再次離心5 min。

• 4. 取上清，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，4℃，12,000g離心10 min。離心后的上清含胞漿成分，可從中提取胞漿蛋白。將上清轉(zhuǎn)移到新離心管，線粒體沉淀在管底。

• 5. 往線粒體沉淀中加入0.5 ml Wash Buffer重懸線粒體沉淀，4℃，1000g離心5 min。

• 6. 取上清，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，4℃，12,000g離心10 min。棄上清，高純度的線粒體沉淀在管底。

• 7. 用50-100 ul Store Buffer 或合適的反應(yīng)緩沖液重懸線粒體沉淀，立即使用或-80℃保存。

最好用Bradford法測定線粒體濃度，對比Bradford法（考馬斯亮藍(lán))和BCA法，兩者都有干擾物質(zhì)，但相比之下Bradford法的干擾物質(zhì)影響更小一點(diǎn)

以下為兩種方法對DTT、EDTA、EGTA和蔗糖等的最大允許濃度