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CTC分離,方法您選對(duì)了嗎?

 文靜ht5ikmva66 2019-02-12

      CTC(循環(huán)腫瘤細(xì)胞,Circulating Tumor Cell)是存在于外周血中的各類(lèi)腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱(chēng)。因自發(fā)或診療操作從實(shí)體腫瘤病灶(原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶)脫落,大部分CTC在進(jìn)入外周血后發(fā)生凋亡或被吞噬,少數(shù)能夠逃逸并發(fā)展成為轉(zhuǎn)移灶,增加惡性腫瘤患者死亡風(fēng)險(xiǎn)。CTC代表的是完整的、有活性的細(xì)胞,科學(xué)家可以提取DNA、RNA、蛋白質(zhì),進(jìn)行不同層次水平的檢測(cè),更加完整的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤動(dòng)態(tài)、評(píng)估治療效果,實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療。


CTC有哪些特點(diǎn)?


  1. 稀有性:每10mL血液中可能僅含有幾個(gè)到幾十個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞。

  2. 非典型性的細(xì)胞形態(tài):一般比血液細(xì)胞,正常組織細(xì)胞體積大;細(xì)胞核大,不規(guī)則,細(xì)胞核質(zhì)比高;不易發(fā)生變形。

  3. 異質(zhì)性:細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物表達(dá)差異;攜帶不同的分子信息;轉(zhuǎn)移潛力差異。

  4. 不同形態(tài)和類(lèi)別:CTC可以是間質(zhì)型、上皮型或者上皮間質(zhì)混合型,CTC也既可以是單個(gè)細(xì)胞的CTC也可以是成團(tuán)的CTCs。

目前CTC分離的方法

       目前市面上CTC富集的方法主要有兩種:生物富集法和物理富集法。前者主要是基于腫瘤細(xì)胞表面特異性表達(dá)的marker,利用磁珠結(jié)合的抗體進(jìn)行陽(yáng)性富集或陰性富集,也可采用流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行分選。后者主要基于細(xì)胞的直徑進(jìn)行富集,比如使用直徑為8微米的濾膜過(guò)濾去除白細(xì)胞分離CTC。


       今天小編給大家介紹的是基于生物富集+顯微成像挑選兩步法進(jìn)行CTC的分離。目前已經(jīng)有研究者使用該方法成功進(jìn)行胰腺癌、乳腺癌和胃食管癌CTC的分離。


       在2017年Lapin等發(fā)表的文章中,作者以21位胰腺癌患者的56份血樣作為研究對(duì)象,首先使用密度梯度離心的方法獲得單核細(xì)胞,然后用鏈霉親和素結(jié)合的beads與標(biāo)記了生物素結(jié)合的CD45、CD16、CD19、CD163以及CD235/GYPA抗體的細(xì)胞進(jìn)行孵育,去除beads結(jié)合的單核細(xì)胞和殘留的紅細(xì)胞,未結(jié)合beads的細(xì)胞即富集好的可能含有胰腺癌CTC的細(xì)胞。

       作者又將這些細(xì)胞進(jìn)行了Hoechst、EpCAM、MCAM以及CD45抗體的標(biāo)記,置于MMI的CellEctor單細(xì)胞挑選系統(tǒng)上面,基于熒光顯微成像,按照細(xì)胞核可見(jiàn)/無(wú)beads結(jié)合/表達(dá)EpCAM-MCAM/不表達(dá)CD45/細(xì)胞圓形或卵圓形的標(biāo)準(zhǔn)在熒光顯微成像下圈選出細(xì)胞,CellEctor自動(dòng)化實(shí)現(xiàn)純的特異性的胰腺癌CTC的分離。作者以此單細(xì)胞進(jìn)行了下游的單細(xì)胞RT-PCR,分析了包括EpCAM在內(nèi)的13個(gè)marker。最終結(jié)果指示胰腺癌CTC的上皮樣分子以及間充質(zhì)樣分子表達(dá)與其它淋巴細(xì)胞不同,癌癥干細(xì)胞(CSC)marker以及胞外基質(zhì)蛋白(ECM)表達(dá)有明顯的升高。這項(xiàng)研究是基于單個(gè)的胰腺癌CTC,研究結(jié)果對(duì)于揭示與CTC向遠(yuǎn)端器官轉(zhuǎn)移并定位相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本以及上皮樣CTC預(yù)示更好的癌癥患者存活率具有重要的理論指導(dǎo)意義。


如上圖所示:藍(lán)色的Hoechst指示細(xì)胞核,綠色的EpCAM/MCAM指示胞膜,紅色的CD45指示淋巴細(xì)胞,最后一列Merge指示完整的CTC。



       在2013年M Pizon等、2011年Hjortland等發(fā)表的文章中,均使用了類(lèi)似的方法分別從乳腺癌患者、胃食管癌患者體內(nèi)分離出CTC進(jìn)行基因表達(dá)、體外培養(yǎng)監(jiān)測(cè)腫瘤球形成的能力、全基因組CGH芯片分析等,為個(gè)體化治療提供了有力的理論依據(jù)。



       基于免疫磁珠富集+顯微成像可視化單細(xì)胞挑選兩步法進(jìn)行CTC的分離已經(jīng)是非常成熟的方法,以往的研究證實(shí)了這是一種高效的、能較好維持細(xì)胞活性特異性獲得純的CTC的方法。其中第二步中使用到的CellEctor德國(guó)MMI公司專(zhuān)門(mén)針對(duì)CTC、干細(xì)胞等罕見(jiàn)細(xì)胞設(shè)計(jì)的基于毛細(xì)管原理的單細(xì)胞挑選系統(tǒng)。該系統(tǒng)以高性能的自動(dòng)倒置顯微鏡為平臺(tái),搭載高精度電動(dòng)載物臺(tái),通過(guò)高精度CellPump簡(jiǎn)單、精準(zhǔn)地實(shí)現(xiàn)CTC、干細(xì)胞及其它罕見(jiàn)細(xì)胞的識(shí)別、吸取及轉(zhuǎn)移。




參考文獻(xiàn):

  1. Barbara,et al. Single-cell analysis of CTCs with diagnostic precision: opportunities and challenges for personalized medicine. Expert Rev. Mol. Diagn. (2016) 16(1), 25–38

  2. Lapin,et al. Single-cell mRNA profiling reveals transcriptional heterogeneity among pancreatic circulating tumour cells. BMC Cancer (2017) 17:390

  3. M Pison,et al. Heterogeneity of circulating epithelial tumour cells from individual patients with respect to expression profiles and clonal growth (sphere formation) in breast cancer. ecancer (2013), 7:343

  4. Geir Olav Hjortland,et al. Genome wide single cell analysis of chemotherapy resistant metastatic cells in a case of gastroesophageal adenocarcinoma. BMC Cancer (2011), 11:455 


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