染色體不穩(wěn)定性（CIN）與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)，但其在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演的角色尚不明確。染色體不穩(wěn)定的細(xì)胞在細(xì)胞分裂后期會(huì)發(fā)生染色體錯(cuò)誤分離，這為靶向探究CIN在癌癥轉(zhuǎn)移中的作用中帶來(lái)了困難。非運(yùn)動(dòng)微管解聚驅(qū)動(dòng)蛋白家族KIF2B或KIF2C（也稱作MCAK）過(guò)度表達(dá)所造成的附著在染色體上的微管的不穩(wěn)定性，能夠直接抑制染色體不穩(wěn)定細(xì)胞中的CIN。過(guò)度表達(dá)KIF2B或MCAK的細(xì)胞可以繼續(xù)以非整倍體進(jìn)行分裂。非整倍體是染色體異常中的一種，因此，可通過(guò)這種方法可以直接檢測(cè)CIN。

樣本選擇：

從基因型和表型（dbGAP）的數(shù)據(jù)庫(kù)中下載具有匹配的原發(fā)性腫瘤和正常組織的79個(gè)腦轉(zhuǎn)移瘤的全外顯子DNA序列數(shù)據(jù)；

研究手段：

• 原發(fā)腫瘤-轉(zhuǎn)移腫瘤的基因組分析

• 頭頸部鱗狀細(xì)胞癌染色體分離分析

• 單細(xì)胞核型分析

• FISH分析

• RHOA和RAC1下拉實(shí)驗(yàn)

• 免疫熒光顯微實(shí)驗(yàn)

• Y染色體錯(cuò)誤分離和FISH實(shí)驗(yàn)

• 在微流體裝置中進(jìn)行細(xì)胞遷移

• 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

• 患者來(lái)源的異種移植實(shí)驗(yàn)

• RNA測(cè)序和分析

• 逆轉(zhuǎn)錄酶定量聚合酶鏈反應(yīng)

• 單細(xì)胞RNA測(cè)序

• 病人生存分析

• 體外侵襲和遷移測(cè)定

• 細(xì)胞質(zhì)DNA定量分析

人轉(zhuǎn)移瘤中CIN增多

圖1  人轉(zhuǎn)移瘤中CIN增多

首先，為了確定CIN是否與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)，研究人員用加權(quán)的基因組完整性指數(shù)（wGII）作為衡量CIN的指標(biāo)，研究人員對(duì)一個(gè)已發(fā)表的79對(duì)原發(fā)癌和轉(zhuǎn)移癌進(jìn)行了分析。分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移瘤中wGII指數(shù)更高（圖1a）。

隨后，對(duì)原發(fā)乳腺癌和轉(zhuǎn)移癌的核型分析發(fā)現(xiàn)原發(fā)癌中均為二倍體，而轉(zhuǎn)移癌中存在大量的三倍體，并且染色體畸變數(shù)量是原發(fā)性腫瘤的兩倍。核型在二倍體~四倍體之間的樣本染色體畸變是最高的（圖1b,c）。

最后，對(duì)局部晚期頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者的原發(fā)腫瘤組織學(xué)分析揭示，細(xì)胞分裂后期染色體錯(cuò)誤分離與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率之前存在顯著的相關(guān)性（圖1d）。

CIN是癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的驅(qū)動(dòng)者

圖2  CIN是癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的驅(qū)動(dòng)者

為了確定CIN與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是不是因果關(guān)系，研究人員用了人(MDA-MB-231)或小鼠(4T1)乳腺癌轉(zhuǎn)移性腫瘤模型和人肺腺癌(H2030)，均發(fā)現(xiàn)了染色體錯(cuò)誤分離的證據(jù)。

過(guò)表達(dá)的KIF2B或MCAK抑制了染色體錯(cuò)誤分離，而過(guò)表達(dá)的顯性抑制MCAK突變體（dnMCAK）促進(jìn)了染色體錯(cuò)誤分離。KIF2B或MCAK的過(guò)表達(dá)不會(huì)影響細(xì)胞增殖和每個(gè)細(xì)胞中心體的數(shù)量（圖2a,b）。作為對(duì)照，研究人員過(guò)表達(dá)了KIF2A（驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員，缺少著絲粒定位結(jié)構(gòu)域），發(fā)現(xiàn)其影響微管解聚，但對(duì)CIN影響不明顯（圖2b）。研究人員將表達(dá)MCAK或KIF2B定義為CIN-low,將表達(dá)KIF2A或dnMCAK定義為CIN-high。

轉(zhuǎn)移癌的核型分析顯示了廣泛的非整倍性（≈3n）染色體和核型異質(zhì)性。抑制CIN同時(shí)減少了單細(xì)胞來(lái)源克隆的異質(zhì)性核型數(shù)目和異質(zhì)性核型結(jié)構(gòu)。而CIN-low細(xì)胞中一些出現(xiàn)了非克隆性結(jié)構(gòu)異常的染色體染色體數(shù)目異質(zhì)性減少。值得注意的是，CIN-low的細(xì)胞仍然維持較高程度的非整倍體核型，但可以穩(wěn)定繁殖。這樣，通過(guò)比較染色體上穩(wěn)定的非整倍體細(xì)胞與染色體不穩(wěn)定非整倍體細(xì)胞，研究人員可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究CIN在轉(zhuǎn)移中的角色。

研究人員通過(guò)給無(wú)胸腺小鼠注射MDA-MB-231細(xì)胞，使用生物熒光標(biāo)記追蹤細(xì)胞的擴(kuò)散情況。在轉(zhuǎn)移上染色體錯(cuò)誤分離的比率顯著不同：注射CIN-high細(xì)胞的小鼠迅速死于轉(zhuǎn)移性疾?。ㄉ嫫谥形粩?shù)70天）；而注射CIN-low細(xì)胞的小鼠轉(zhuǎn)移負(fù)擔(dān)比較低。生存期中位數(shù)207天。CIN-low的轉(zhuǎn)移會(huì)逐漸衰退，有的會(huì)自愈；而CIN-high的細(xì)胞會(huì)轉(zhuǎn)移多個(gè)器官，進(jìn)展迅速，導(dǎo)致死亡。人肺腺癌細(xì)胞中有類似結(jié)果（圖2c-e）。MCAK表達(dá)細(xì)胞中MAD2過(guò)表達(dá)減少了部分染色體錯(cuò)誤分離，并相應(yīng)的增強(qiáng)轉(zhuǎn)移（圖2c）。研究人員還實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CIN抑制對(duì)原發(fā)癌的著床效率無(wú)影響。但顯著減少了自發(fā)轉(zhuǎn)移并延長(zhǎng)生存期。

圖3  CIN在原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移灶中的作用相反

然后研究人員評(píng)估了注射細(xì)胞、原發(fā)癌細(xì)胞、轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞中的染色體錯(cuò)誤分離情況（圖3a）。主要使用MDA-MB-231細(xì)胞、ER+和TNBC病人的細(xì)胞。注射細(xì)胞中，無(wú)論CIN狀態(tài)如何，轉(zhuǎn)移細(xì)胞中染色體錯(cuò)誤分離比例更高些，然原發(fā)瘤中CIN水平明顯偏低（圖3b-d）。

間充質(zhì)細(xì)胞富含CIN

Bulk RNA-seq分析在CIN-low細(xì)胞和CIN-high細(xì)胞中共鑒定了1584個(gè)顯著差異表達(dá)的基因。主成分分析和聚類分析均根據(jù)CIN狀態(tài)分離了樣本。轉(zhuǎn)移相關(guān)和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)基因在CIN-high細(xì)胞中顯著富集。CIN-high細(xì)胞中最顯著差異表達(dá)的基因在功能上與無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存（DMFS）有關(guān)。數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源的乳腺癌數(shù)據(jù)中的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)也是類似。

原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移瘤RNA-seq分析顯示了轉(zhuǎn)移和CIN-high細(xì)胞之間的通路。但是轉(zhuǎn)移瘤中包含了大量上調(diào)EMT和炎癥相關(guān)基因不成比例的聚集在1號(hào)染色體。核型分析顯示在注射的細(xì)胞和轉(zhuǎn)移的細(xì)胞中，1號(hào)染色體均是3份拷貝，而原發(fā)癌中僅是2倍體。這樣在這個(gè)模型中，1號(hào)染色體丟失是原發(fā)癌生長(zhǎng)的一個(gè)高頻事件。

圖4  間充質(zhì)細(xì)胞富含CIN

然后研究人員分別在3株MDA-MB-231細(xì)胞系（2個(gè)CIN-low和1個(gè)CIN-high），共6,821個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行了單細(xì)胞RNA-seq（scRNA-seq）分析。EMT相關(guān)基因聚類分析，根據(jù)CIN狀態(tài)，成功的將大多數(shù)細(xì)胞分類（圖4a）。所有表達(dá)基因的聚類分析確定了12個(gè)亞型。一個(gè)亞群被定義為EMT和轉(zhuǎn)移相關(guān)的高表達(dá)，并且伴隨著豐富的CIN特征基因。與6%的CIN-low細(xì)胞相比，這個(gè)亞群45%的是dnMCAK細(xì)胞（圖4b）。

CIN產(chǎn)生胞漿DNA

圖5  CIN產(chǎn)生胞漿DNA

為了確認(rèn)CIN應(yīng)答途徑，研究人員用scRNA-seq的數(shù)據(jù)，計(jì)算基因間的Pearson相關(guān)性系數(shù)，確認(rèn)了2大基因模塊：模塊1與細(xì)胞增殖和代謝有關(guān)；模塊2與EMT（上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化）和炎癥相關(guān)（圖5a）。而且scRNA-seq和bulk RNA-seq數(shù)據(jù)皆證實(shí)了炎癥相關(guān)基因、CIN特征、EMT基因間強(qiáng)烈的正相關(guān)關(guān)系（圖4b，圖5b）。

CIN應(yīng)答途徑與炎癥反應(yīng)相關(guān)，這個(gè)結(jié)果出乎意料，并且讓人聯(lián)想到病毒感染。因此研究人員研究了CIN是否將染色體DNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而引起了抗病毒免疫的炎癥反應(yīng)。染色體DNA暴露到細(xì)胞質(zhì)可能是由細(xì)胞核或者微核包膜破裂。研究人員采用NLS–GFP進(jìn)行活細(xì)胞成像，發(fā)現(xiàn)在沒(méi)有限制的條件下，CIN和染色體DNA暴露到細(xì)胞質(zhì)是沒(méi)有相關(guān)性的。在CIN-high細(xì)胞中甚至有細(xì)胞核修復(fù)的趨勢(shì)。CIN-high僅在限制遷移的時(shí)候核破裂更加頻繁，這可能是與它們?cè)谵D(zhuǎn)移過(guò)程中模仿受限遷移的能力增強(qiáng)有關(guān)。

相反地，CIN-high細(xì)胞和轉(zhuǎn)移來(lái)源細(xì)胞的微核數(shù)目要分別比CIN-low或者原發(fā)瘤細(xì)胞多（圖5c-e）。為了驗(yàn)證微核易破裂是否和細(xì)胞質(zhì)DNA增多有關(guān)，研究人員選擇了質(zhì)膜選擇性透過(guò)的兩種不同的anti-dsDNA抗體進(jìn)行細(xì)胞染色，在CIN-high細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)增多的細(xì)胞質(zhì)dsDNA和ssDNA。在雙鏈特異核酸酶處理以及DNASE2過(guò)表達(dá)后dsDNA信號(hào)消失（圖5f）。亞細(xì)胞分離之后，與CIN-high細(xì)胞相比，CIN-low的細(xì)胞質(zhì)DNA減少為四分之一（圖5g）。

為了驗(yàn)證染色體錯(cuò)誤分離是否提供了細(xì)胞質(zhì)DNA，研究人員使用了在染色體穩(wěn)定的大腸癌腫瘤細(xì)胞DLD-1中建立的可誘導(dǎo)Y染色體錯(cuò)誤分離系統(tǒng)。發(fā)現(xiàn)在多西環(huán)素和生長(zhǎng)素（Dox/IAA）處理2-3天后，Y染色體進(jìn)入到微核中（圖5h）。從而證實(shí)了細(xì)胞質(zhì)DNA來(lái)源于高發(fā)生率的染色體錯(cuò)誤分析。

抑制微核包膜破裂減少了細(xì)胞質(zhì)中的雙鏈DNA，不影響染色體分離的錯(cuò)誤率。實(shí)際上，MDA-MB-231細(xì)胞心內(nèi)或尾靜脈注釋后，這種過(guò)表達(dá)減少了轉(zhuǎn)移（圖5i）。

轉(zhuǎn)移原于細(xì)胞質(zhì)DNA的反應(yīng)

圖6  轉(zhuǎn)移原于細(xì)胞質(zhì)DNA的反應(yīng)

在染色體穩(wěn)定的細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)dsDNA是非常少的，且可被cGAS–STING通路感知，導(dǎo)致I型干擾素刺激基因（ISGs）的誘導(dǎo)。事實(shí)上，在DLD-1中，誘導(dǎo)Y染色體分析導(dǎo)致了OAS2、ISG基因的上調(diào)和β干擾素的增加。目前不確認(rèn)染色體不穩(wěn)定的細(xì)胞如何應(yīng)對(duì)持續(xù)的細(xì)胞質(zhì)DNA。抑制微核破裂明顯的減少了cGAS+的相對(duì)分?jǐn)?shù)（圖6a，b）。此外，與通路激活一致，CIN-high細(xì)胞展示了增高的水平和SITNG核定位（圖6c）。

細(xì)胞質(zhì)DNA能夠激活NF-κ B通路。研究人員發(fā)現(xiàn)了CIN-high中非經(jīng)典NF-κ B通路被激活、NF-κ B通路抑制劑TRAF2減少的證據(jù)。STING的消耗減少了RELB的核定位，導(dǎo)致了EMT和炎癥通路的下調(diào)；而在MCAK表達(dá)細(xì)胞中cGAMP增加或MAD2過(guò)表達(dá)增加了細(xì)胞核中的RELB基因（圖6d）。

Bulk RNA-seq鑒定了一些非經(jīng)典NF-κ B通路的靶基因（在CIN中上調(diào)）。STING、CIN應(yīng)答的NC-NF-κ B基因具有很強(qiáng)的相關(guān)性。相比之下CIN和I型干擾素靶基因間的相關(guān)性較弱（圖5b）。類似地，TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中原發(fā)乳腺癌RNA-seq數(shù)據(jù)顯示了在CIN特征明顯的腫瘤中CIN應(yīng)答NC-NF-κB基因表達(dá)量增加（圖6e），并且NF-κ B通路調(diào)節(jié)因子表達(dá)量升高，它的CIN應(yīng)答靶基因與乳腺癌和肺癌生存時(shí)間延長(zhǎng)有關(guān)。相反地，正常型核的NF-κ B或I型干擾素調(diào)控因子表達(dá)量增加與預(yù)后改善有關(guān)。

cGAS被腫瘤細(xì)胞通過(guò)腫瘤細(xì)胞非自主機(jī)制在腦轉(zhuǎn)移中激活。研究人員發(fā)現(xiàn)STING和下游非經(jīng)典NF-κB通路以腫瘤細(xì)胞自主的方式介導(dǎo)轉(zhuǎn)移，減少轉(zhuǎn)移，延長(zhǎng)生存時(shí)間。相反地，cGAMP增加促進(jìn)了細(xì)胞的侵襲和遷移（圖6f，g）。這些發(fā)現(xiàn)與EMT中非經(jīng)典NF-κB通路、細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用相一致。

這篇文章揭示了CIN、細(xì)胞質(zhì)DNA感應(yīng)通路慢性激活和細(xì)胞轉(zhuǎn)移之間的聯(lián)系。除了需要加劇染色體異質(zhì)性作為自然選擇的底物外，還需要持續(xù)的染色體錯(cuò)誤分離來(lái)提供細(xì)胞質(zhì)DNA并維持促轉(zhuǎn)移狀態(tài)。因此，即使是高度非整倍體細(xì)胞，抑制CIN也可以減少細(xì)胞轉(zhuǎn)移。STING激活的影響是依賴于上下傳導(dǎo)通路的協(xié)調(diào)激活。

由于染色體不穩(wěn)定細(xì)胞存在大量的細(xì)胞質(zhì)DNA，正常的炎癥反應(yīng)恢復(fù)為靶向染色體不穩(wěn)定細(xì)胞提供了可行的治療策略。

CIN的出現(xiàn)及隨后的耐受性是腫瘤演化過(guò)程中的一個(gè)重要節(jié)點(diǎn)。研究人員發(fā)現(xiàn)CIN誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞從高度代謝狀態(tài)向間充質(zhì)狀態(tài)轉(zhuǎn)錄移位。轉(zhuǎn)移瘤的泛基因組分析發(fā)現(xiàn)的這兩種互斥的細(xì)胞狀態(tài)解釋了腫瘤形成早期染色體非整倍性的負(fù)面影響。同時(shí)，該研究還揭示，CIN通過(guò)EMT和炎癥驅(qū)動(dòng)腫瘤的轉(zhuǎn)移。

參考文獻(xiàn)：

[1] Samuel F. Bakhoum,Bryan Ngo, et al. [J]. Nature, 2018,553: 467–472.