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中藥雙向發(fā)酵技術(shù)的制作方法 【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種中藥雙向發(fā)酵技術(shù)。具體步驟包括中藥預(yù)處理，發(fā)酵菌種的選擇及活化，最佳發(fā)酵方式的確定，通過(guò)發(fā)酵試驗(yàn)分析發(fā)酵產(chǎn)物有效活性成分變化，以此評(píng)估新型發(fā)酵炮制中藥的藥效。本發(fā)明利用中藥及微生物所特有的藥性及功能成分，通過(guò)二者的深層次相互作用提升其抗氧化、抗自由基、增強(qiáng)免疫力等醫(yī)療保健功能。 【專利說(shuō)明】中藥雙向發(fā)酵技術(shù) 【技術(shù)領(lǐng)域】 [0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種以中藥為原料的微生物雙向發(fā)酵技術(shù)?！颈尘凹夹g(shù)】[0002]中藥發(fā)酵技術(shù)是一種古老的傳統(tǒng)中藥加工技術(shù)，如傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品有淡豆鼓、百藥煎、豆黃、六神曲、建神曲、半夏曲、沉香曲等。微生物發(fā)酵法是生物轉(zhuǎn)化的方法之一，在中藥領(lǐng)域中早有應(yīng)用，可以提高中草藥中活性成分的含量。目前，微生物發(fā)酵中藥已成為中藥研究的新內(nèi)容，利用微生物中的酶系與中藥中復(fù)雜的化學(xué)成分反應(yīng)，可以改變某一成分含量或產(chǎn)生一些中藥中不具有的潔性成分，達(dá)到改變藥性、增強(qiáng)藥效、降低毒副作用、增加適應(yīng)性的目的，從而為中藥有效化合物的篩選提供了新的途徑。如《飲片新參》記載，半夏加姜計(jì)、磯水和豆餅發(fā)酵成〃半夏曲〃后，藥性由〃溫辛，有毒〃變成了 〃苦辛，平〃，其原有的猛烈的藥力得到明顯緩解。發(fā)酵對(duì)中藥潔性成分的影響，可以從4個(gè)方面概括:(I)微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生生物潔性物質(zhì)，包括多種酶、抗生素等。這些酶可以催化中藥成分的分解，或轉(zhuǎn)化成其他成分，如中藥淡豆鼓，經(jīng)過(guò)發(fā)酵過(guò)程，其皂昔類成分發(fā)生了變化，轉(zhuǎn)化為游離的苷元，具有更強(qiáng)的生理潔性。(2)微生物的次生代謝過(guò)程中產(chǎn)生活性化合物。(3)中藥所含的某些成分可以改變微生物的代謝途徑，形成新的成分或改變各成分的相互比例。 (4)微生物的代謝可以將中藥中的有效成分轉(zhuǎn)化成新的化合物，同時(shí)微生物的次生代謝產(chǎn)物和中藥中的成分發(fā)生反應(yīng)，也能產(chǎn)生新的化合物。 [0003]但直到目前，對(duì)中藥發(fā)酵的基礎(chǔ)理論方面及加工工藝技術(shù)上的研究仍處于起步階段，對(duì)單味藥材發(fā)酵和傳統(tǒng)復(fù)方發(fā)酵的深度開(kāi)發(fā)非常有限，同時(shí)中藥發(fā)酵技術(shù)也面臨一些問(wèn)題:安全性評(píng)估不充分、產(chǎn)品未標(biāo)準(zhǔn)化、功效成分不明確等。因此，對(duì)中藥發(fā)酵關(guān)鍵技術(shù)的正確把握關(guān)系到中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展方向和前景。 【發(fā)明內(nèi)容】 [0004]中藥雙向發(fā)酵技術(shù)系采用不同的中藥材為底物組成不同的藥性基質(zhì)，或在營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)中加入具有潔性成分的中藥材組成全性基質(zhì)，或用兩種以上中藥材經(jīng)交叉組合成為多樣性(復(fù)方)基質(zhì)，通過(guò)接種不同的菌種如藥用真菌，使發(fā)酵的作用從原來(lái)單向性的、僅由農(nóng)副產(chǎn)品構(gòu)成的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)提供微生物大量生長(zhǎng)菌體并產(chǎn)生各種代謝物質(zhì)所需的C、N源等營(yíng)養(yǎng)成分，發(fā)展到應(yīng)用菌種的酶使藥性基質(zhì)的組織、成分分解、變化、產(chǎn)生新的成分，使發(fā)酵作用演變成雙向性，從而形成新的性昧、功能不同的藥性菌質(zhì)或全性菌質(zhì)，故具有雙向性或多樣性。再用此類菌質(zhì)進(jìn)行藥理模型篩選后，可以獲得不同的中藥產(chǎn)品。就發(fā)酵產(chǎn)物的類型而言，有下列幾種類型:(I)以菌種菌體為目的產(chǎn)物的菌體發(fā)酵；(2)以菌體代謝產(chǎn)物(初級(jí)和次級(jí)代謝產(chǎn)物)為目的產(chǎn)物發(fā)酵；(3)利用菌體細(xì)胞的一種或多種酶的修飾作用把一種 化合物如中藥材中的某類大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)變成結(jié)構(gòu)相關(guān)的更有藥用價(jià)值的其他化合物； (4)以菌種的酶(含蛋白)為產(chǎn)物的酶發(fā)酵。本發(fā)明以中藥為主要發(fā)酵基質(zhì)，用菌種尤其是藥用真菌進(jìn)行雙向發(fā)酵，以研究二者之間相互作用對(duì)抗氧化性的影響及其活性成分含量變化， 旨在探索出一種提高中藥發(fā)酵度及其藥效的技術(shù)和途徑。本發(fā)明的目的是按如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，其特征是它包括以下步驟: (1)中藥預(yù)處理(切片、磨粉、浸提等)； (2)發(fā)酵種子液的制備(對(duì)選取的菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng))； (3)最適發(fā)酵培養(yǎng)基的確定(分別以單一中藥、中藥復(fù)合培養(yǎng)基為基礎(chǔ)；對(duì)中藥添加量、非藥物部分含量如麥麩、玉米芯及料液比進(jìn)行確定)； (4)最佳發(fā)酵方式、條件的確定(固態(tài)、液態(tài)方式及最適溫度、時(shí)間、通氧量、接種量、pH)； (5)進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)動(dòng)態(tài)跟蹤分析發(fā)酵產(chǎn)物有效活性成分變化(總多糖、總黃酮、纖維素酶活性、HPLC測(cè)定發(fā)酵前后指紋圖譜變化未確定新藥效成分)，發(fā)酵最終產(chǎn)物的抗氧化活性(清除羥基自由基、過(guò)氧游離基、DPPH自由基試驗(yàn))及免疫力(單核吞噬細(xì)胞如肝竇內(nèi)表面的吞噬細(xì)胞KupfTer細(xì)胞的數(shù)目及吞噬能力)提升； (6)根據(jù)以上所有結(jié)果來(lái)評(píng)估新型發(fā)酵炮制中藥的藥效。 [0005]本發(fā)明的有益效果 (I)工藝簡(jiǎn)單，設(shè)備要求不高，適于工業(yè)化推廣。 [0006](2)利用中 藥及微生物所特有的藥性及功能成分，通過(guò)二者的深層次相互作用提升其抗氧化、抗自由基、增強(qiáng)免疫力等醫(yī)療保健功能。 [0007](3)促進(jìn)中藥產(chǎn)業(yè)升級(jí)和健康發(fā)展，為中藥加工企業(yè)開(kāi)發(fā)新產(chǎn)品提供一定的技術(shù)支撐和參考依據(jù)。 【具體實(shí)施方式】 [0008]下面的實(shí)施例可以進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。 [0009]實(shí)施例1 液態(tài)雙向發(fā)酵--稱取干制大黃(Rheum officinale) 若干kg,通過(guò)粉碎機(jī)研磨 成粉末，然后加入8倍質(zhì)量水溶液，攪拌并浸泡3小時(shí)；然后2000r/min離心15min，取上清液；以靈芝(Ganodorma Iucidum)為發(fā)酵藥用真菌種子，PDA斜面培養(yǎng)基活化，采用玉米粉液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)；通過(guò)在設(shè)定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入30%濃度的大黃水提取液，制成全 性培養(yǎng)基(玉米芯:麥麩 1: 3，MgS04 (0.05% )、(NH4) 2S04 (0.2 % )、KH2P04(0.1% )均 為質(zhì)量濃度)。接入靈芝種子液，置于在28 OC、搖床轉(zhuǎn)速160r，自然ph條件下，培養(yǎng)7d;然后即可進(jìn)行化學(xué)檢測(cè)，測(cè)量靈芝的生物量及菌絲球直徑。再對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行DPPH清除率、還原力及非特異性免疫能力測(cè)定；最后對(duì)發(fā)酵中藥的藥性做出評(píng)估。 [0010]實(shí)施例2 液態(tài)雙向發(fā)酵稱職干制黃芪(Radix Astragali)若干，通過(guò)粉碎機(jī)研磨成40目大小粉末，然后按1: 8的料液比加入水溶液，(即IOg黃芪粉末加入80mL純水)，攪拌并浸泡I小時(shí)；然后1000r-3000r/min離心15min，取上清液；以靈芝為發(fā)酵藥用真菌種子，PDA斜面培養(yǎng)基活化，采用玉米粉液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)；通過(guò)在設(shè)定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入30% (占培養(yǎng)基的全重量)濃度的黃瓦水提取液，制成全性培養(yǎng)基(玉米芯:麥麩=1: 3，MgSO4 (0.05% )、(NH4) 2S04 (0.2 % )、KH2PO4 (0.1% )均為質(zhì)量濃度)。 [0011]接入靈芝種子液，置于在28V、搖床轉(zhuǎn)速160r，培養(yǎng)7d ;然后即可進(jìn)行化學(xué)檢測(cè)，測(cè)量靈芝的生物量及菌絲球直徑。再對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行苯酚硫酸法測(cè)定總多糖含量，絡(luò)合一分光廣度法測(cè)定總黃酣含量，PH計(jì)測(cè)定發(fā)酵液酸度，DPPH清除固態(tài)雙向發(fā)酵稱職干制黃芪若干，通過(guò)粉碎機(jī)研磨成40目大小粉末；以靈芝為發(fā)酵藥用真菌種子，PDA斜面培養(yǎng)基活化，采用玉米粉液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)；通過(guò)在設(shè)定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入3% (占培養(yǎng)基的全重量)濃度的黃芪粉末 ，制成全性培養(yǎng)基(玉米芯:麥款=I: 3，MgSO4 (0.05%)、(NH4) 2S04 (0.2 % )、KH2PO4 (0.1% )均為質(zhì)量濃度)。接入靈芝種子液，置于在28°C、通過(guò)機(jī)械通風(fēng)來(lái)控制通氧量，自然Ph條件下，培養(yǎng)7d;然后即可進(jìn)行化學(xué)檢測(cè)，測(cè)量靈芝的生物量及菌絲球直徑。再對(duì)發(fā)酵物進(jìn)行苯酚一硫酸法測(cè)定總多糖含量，絡(luò)合一分光廣度法測(cè)定總黃酮含量，PH計(jì)測(cè)定發(fā)酵液酸度，DPPH清除率、還原力及非特異性免疫能力進(jìn)行測(cè)定；最后對(duì)發(fā)酵中藥的藥性做出評(píng)估。 【權(quán)利要求】 1.中藥雙向發(fā)酵技術(shù)，其特征在于步驟如下: (1)中藥預(yù)處理(切片、磨粉、浸提等)； (2)發(fā)酵種子液的制備(對(duì)選取的菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng))； (3)最適發(fā)酵培養(yǎng)基的確定(分別以單一中藥、中藥復(fù)合培養(yǎng)基為基礎(chǔ)；對(duì)中藥添加量、非藥物部分含量如麥麩、玉米芯及料液比進(jìn)行確定)； (4)最佳發(fā)酵方式、條件的確定(固態(tài)、液態(tài)方式及最適溫度、時(shí)間、通氧量、接種量、pH)； (5)進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)動(dòng)態(tài)跟蹤分析發(fā)酵產(chǎn)物有效活性成分變化(總多糖、總黃酮、纖維素酶活性、HPLC測(cè)定發(fā)酵前后指紋圖譜變化來(lái)確定新藥效成分)，發(fā)酵最終產(chǎn)物的抗氧化活性(消進(jìn)基自由基、過(guò)氧游離基、DPPH自由基試驗(yàn))及免疫力(單核吞噬細(xì)胞如肝竇內(nèi)表面的吞噬細(xì)胞KupfTer細(xì)胞的數(shù)目及吞噬能力)提升； (6)根據(jù)以上所有結(jié)果來(lái)評(píng)估新型發(fā)酵炮制中藥的藥效。 【文檔編號(hào)】A61K36/481GK103565944SQ201310581627 【公開(kāi)日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月20日 【發(fā)明者】不公告發(fā)明人 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué) |
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