A
AgNOR染色法: 1、試劑配制: (1)AgNOR染色液: 甲液:明膠2 g 溶于雙蒸水至99 ml,在60℃使之完全溶解,再加入純甲酸1 ml 搖勻待用。 乙液:硝酸銀50 g 溶解于雙蒸水中至100 ml,4℃冰箱保存。 (2)AgNOR工作液 取甲液10 ml,乙液20 ml 臨用前混合。 2、步驟: (1)切片脫蠟至水 (2)雙蒸水洗2次 (3)AgNOR 工作液中(25℃)浸染30分鐘(暗處進(jìn)行)(鏡下觀察) (4)雙蒸水洗3次 (5)脫水,透明,封固 3、結(jié)果:油鏡觀察,細(xì)胞核及胞質(zhì)背景為淡黃色, AgNOR呈棕黑色顆粒狀。 B 鞭毛染色法: 1.試劑配制: 甲液:丹寧酸 5克 氯化鐵(FeCl3) 1.5克 福爾馬林(15%) 2.0毫升 氫氧化鈉(NaOH)1% 1.0毫升 乙液:硝酸銀(AgNO3) 2克 蒸餾水 100毫升 制備乙液時,待硝酸銀溶解后,取出10毫升備用,向余下的90毫升硝酸銀液中滴加濃氫氧化銨,先呈很濃厚的沉淀,再繼續(xù)滴加至剛剛?cè)芙獬恋沓沙吻逡簽橹?。再將備用的硝酸銀溶液慢慢逐滴加入澄清液中,先呈現(xiàn)薄霧,但輕搖則消失,繼續(xù)邊滴加邊搖動,待澄清液呈現(xiàn)略有輕微不消散的薄霧狀為止。如霧重,則銀鹽沉淀,不宜使用。 2.染色方法: (1)將待檢菌接種在新制備的肉湯瓊脂斜面上,置37°培養(yǎng)16—20小時,備用。 (2)在載玻片的中部相隔一厘米處,用接種環(huán)各沾一滴蒸餾水,然后用接種環(huán)挑取濕潤處的菌苔少許于一端的水滴中,傾斜玻片使培養(yǎng)物流至另一水滴中,兩水滴自然相通,菌體從上位自然擴(kuò)散到下位水滴中,待干燥后染色。 (3)在干燥涂片上加甲液3—5分鐘,用蒸餾水沖洗。將殘水瀝干或用乙液沖去殘水后,加適量乙液保持30—60秒鐘。染色時在酒精燈上稍加熱,使染液出現(xiàn)蒸汽即可,用蒸餾水沖洗。 (4)鏡檢:菌體及鞭毛皆染成茶色。 3.注意事項(xiàng): (1)染液最好隨用隨配,存放至次日效果則差。 (2)一定要充分洗凈甲液后再加乙液,否則背景較臟。 (3)防止水及培養(yǎng)物沾有氯化物。 (4)切忌用接種環(huán)涂抹培養(yǎng)物。 (5)載玻片一定要洗凈。先用洗衣粉煮沸,再水洗,干后放在洗液中,浸泡24小時,取出水洗除去殘酸,瀝干,存放于95%乙醇中備用。 (6)加熱時最好置金屬板上,使載玻片受熱均勻。 β-半乳糖苷酶可以催化二糖乳糖水解為單糖:葡萄糖和半乳糖。 β-半乳糖苷酶的活性可以用X-gal(5-溴-4-氫-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)等顯色底物加以檢測,β-半乳糖苷酶可將X-gal轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘纳钏{(lán)色沉淀。 X-gal可以做為組織染色劑,可以在所有表達(dá)β-半乳糖苷酶的植物和動物組織上產(chǎn)生顏色。 應(yīng)該是可以用來病毒感染組織切片染色的。 C CAE染色步驟 1、試劑配制: (1)A液:萘酚-AS—D氯醋酸10mg溶于N,N-二甲基甲酰胺1ml中。 (2)4%副品紅液:取鹽酸副品紅(EM級)1g,溶于蒸餾水20ml內(nèi),再加入10m1/L的HCl 5m1,稍加溫以增加溶解度,過濾、貯室溫下。于使用前,取等量副品紅液與新鮮的4%亞硝酸鈉混合,之后用淀粉碘化物試紙測試,瞬間試紙應(yīng)變?yōu)樗{(lán)色才合格,如果不變色,應(yīng)加入更多的亞硝酸鹽。 (3)B液:o.1mol/L的Michaelis Veronal-醋酸緩沖液(PH 7.6)30ml,加入新配制的副品紅液3滴,用1moI/L HCl使PH值調(diào)至6.3。 2、染色步驟: (1)將A.、B二液混合,過濾,加入氟化鈉(17mg/10ml), 使之最后濃度為0.04mol/L. (2)切片置于上述溶液內(nèi)孵育1h(30℃) (3)流水沖洗。 (4)蘇木素復(fù)染。 (5)空氣干燥后封固。 G Grimelius硝酸銀反應(yīng)法(嗜銀反應(yīng)): 1、試劑配制: 硝酸銀液: 1%硝酸銀水溶液 3毫升 蒸餾水 87毫升 0.2M醋酸緩沖液(PH5.6) 10毫升 還原液: 對苯二酚 1克 亞硫酸鈉 5克 蒸餾水 100毫升 2、染色步驟: (1)切片脫蠟至蒸餾水 (2)60℃硝酸銀液內(nèi)3小時 (3)用濾紙吸去周圍銀液,蒸餾水速洗 (4)入45℃的還原液處理1分鐘 (5)蒸餾水洗 (6)5%硫代硫酸鈉處理1 分鐘(可不做) (7)水洗,脫水,透明,封固 3、結(jié)果:嗜銀顆粒呈棕黑色。正常時嗜銀顆粒存在于神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞,故此法主要用于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的診斷。 H HID染色法1、染色步驟: (1)切片脫蠟至蒸餾水 (2)放入預(yù)熱的1當(dāng)量鹽酸中10分鐘 (3)蒸餾水洗 (4)Schiff液中染10分鐘 (5)自來水洗15分鐘至細(xì)胞核紅色(如2~5步不做,可在染好愛先藍(lán)后染核固紅2分鐘) (6)蒸餾水洗 (7)高鐵二胺液 18~24 小時 (8)愛先藍(lán)液(pH2.5)染10~20分鐘 (9)蒸餾水洗 (10)脫水,透明,封固 2、結(jié)果: 硫酸化酸性粘液呈棕黑色,羧基化酸性粘液(唾酸粘液)物質(zhì)藍(lán)色。硫酸化酸性粘液可見于大腸粘膜,而小腸粘膜僅出現(xiàn)唾酸粘液,此法多用于確定腸化的分型。 HP(硝酸銀法) 1、試劑配制: (1)醋酸緩沖貯備液,PH3.6 0.2N醋酸緩沖液,PH3.6 10 ml 蒸餾水 240 ml 以下各液均用此液配制 (2)1 %硝酸銀液 硝酸銀 1 g 醋酸緩沖貯備液,PH3.6 100 ml (3)2 %硝酸銀液 硝酸銀 0.2 g 醋酸緩沖貯備液,PH3.6 10 ml (4)5 %明膠液 明膠 5 g 醋酸緩沖貯備液,PH3.6 100 ml 先把醋酸緩沖貯備液加溫至40℃左右,然后傾入明膠,于37℃溫箱內(nèi)慢慢溶解,攪 拌。 (5)3 %對苯二酚液 對苯二酚 0.3 g 醋酸緩沖貯備液,PH3.6 10 ml (6)明膠對苯二酚液 3 %對苯二酚液 1 ml 5 %明膠液 15 ml (7)顯影液 明膠對苯二酚液 16 ml 2 %硝酸銀液 3 ml 在操作到第4步完成前5分鐘充分混合,置于56℃水浴箱中保溫待用。 2、操作方法: (1)組織脫蠟至蒸餾水 (2)醋酸緩沖貯備液洗2次 (3)入1 %硝酸銀液中,56℃,1小時 (4)切片不水洗,直接放入預(yù)熱的顯影液中56℃,肉眼呈黃棕色為止。 (5)傾去顯影液,于56℃的水中浸洗2分鐘 (6)水洗 (7)脫水,透明,封固。 3、結(jié)果:幽門彎曲菌呈棕黑至黑色。 Highman甲醇剛果紅染色法(類淀粉染色) 1、試劑配制: 甲醇剛果紅染液: 剛果紅 0.5 g 甲醇 80 ml 甘油 20 ml 堿性乙醇分化液: 氫氧化鉀 0.2 g 80%乙醇 100 ml 2、染色步驟: (1)切片脫蠟至水 (2)甲醇剛果紅染液染10~20分鐘 (3)用堿性乙醇分化液分化數(shù)秒 (4)水洗 (5)蘇木素復(fù)染2分鐘 (6)水洗 (7)脫水,透明,封固 3、結(jié)果:淀粉樣物呈桔紅色。 4、類淀粉染色的應(yīng)用: 確定淀粉樣變性及玻璃樣變性的膠原組織,后者在剛果紅法染色后呈淡桔色,常用于診斷甲狀腺髓樣癌和胰島細(xì)胞瘤等。 L 六胺銀染色法1、試劑配制: 六胺銀液配制: 3%六次甲基四胺水溶液 5 ml 2.5%硝酸銀水溶液 0.5 ml 搖晃,變清,再加2.5%四硼酸鈉1.5~2 ml加蒸餾水至30~40 ml 2、步驟: (1)切片脫蠟至水,蒸餾水洗 (2)0.5%高碘酸浸15分鐘,蒸餾水洗 (3)六胺銀液60℃,1-2小時,(或六胺銀液80-90℃,半小時左右)蒸餾水洗(鏡下基底膜呈黑色) (4)0.2% 氯化金調(diào)色數(shù)秒 (5)麗春紅淡染 (6)水速洗 (7)烘干,透明,封片。 3、結(jié)果:腎小球基底膜呈黑色,霉菌,彈力纖維及一些網(wǎng)狀纖維也呈黑色。 M Mallory 三色法1、步驟 (1)切片脫蠟至水 (2)0.5%酸性復(fù)紅水溶液1 min (3)蒸餾水洗 (4)入下液1-2min 苯胺藍(lán)0.5g,桔黃G 2g,磷目酸或磷鎢酸 1g,蒸餾水100ml。 (5)蒸餾水洗 (6)95%乙醇分色 (7)脫水,透明,封片。 2、結(jié)果:膠原纖維藍(lán)色, 紅細(xì)胞桔黃色,核紅色。 Mallory磷鎢酸~蘇木素染色法(PTAH) 1、試劑配制: 蘇木素 0.1 g 磷鎢酸 2.0 g 蒸餾水 100 ml 先將蘇木素加熱溶于20毫升蒸餾水,再將磷鎢酸溶于80毫升蒸餾水。等蘇木素冷卻后,加入磷鎢酸溶液,混合,放置數(shù)星期后,才可使用。如急用,可加入0.2 g高錳酸鉀,加速其成熟。 2、染色步驟: (1)切片脫蠟至蒸餾水。 (2)放入0.25%高錳酸鉀水溶液5分鐘。 (3)蒸餾水洗。 (4)2.5%草酸漂白5分鐘。 (5)蒸餾水洗多次。 (6)置于磷鎢酸蘇木素溶液12~24小時。 (7)95%酒精快速分化,濾紙吸去剩余酒精,置60℃溫箱中烘干。 (8)二甲苯透明,封固。 3、結(jié)果:纖維膠質(zhì),肌膠質(zhì),神經(jīng)膠纖維,纖維素,橫紋肌等均染成藍(lán)色。膠原,網(wǎng)狀纖維和骨基質(zhì)著黃色或磚紅色。在工作中常用于觀察橫紋以證實(shí)腫瘤細(xì)胞是否有橫紋肌分化特征。 Masson 三色染色法、 1、試劑配制: 麗春紅酸性品紅液: 麗春紅 0.7 g 酸性品紅 0.3 g 蒸餾水 99ml 冰醋酸 1 ml 苯胺藍(lán)液: 苯胺藍(lán) 2 g 蒸餾水 98 ml 醋酸 2 ml 亮綠液: 亮綠 0.2g 蒸餾水 100 ml 冰醋酸 0.2 ml 苦味酸酒精液:苦味酸在95%酒精中的飽和液 20 ml,加95%酒精10 ml 2、染色步驟: (1)切片脫蠟至蒸餾水 (2)蘇木素染5~10分鐘 (3)鹽酸酒精分化 (4)流水藍(lán)化,蒸餾水洗(蘇木素可不染) (5)麗春紅酸性品紅液中染5~8分鐘 (6)蒸餾水洗 (7)1% 磷鉬酸中染1~3分鐘 (8)不用水洗直接入苯胺藍(lán)液或亮綠液5分鐘 (如染色效果不佳,可在冰醋酸內(nèi)脫色后重染) (9)水速洗,置60℃溫箱中烘干,二甲苯透明,封固 3、結(jié)果:膠原纖維藍(lán)色(苯胺藍(lán)復(fù)染)或綠色(亮綠復(fù)染),肌纖維、纖維素紅色。 4、注意: (1) 此法廣泛用于膠原纖維和平滑肌的鑒別,也為腎組織活檢,觀察腎小球病變的重要染色法,常用于觀察缺血病變的心肌。 用于觀察腎小球病變時,一定要用2um以下半薄切片。 (2) 細(xì)胞核染色后分化很重要,觀察控制著色程度。而HE染色則是最常用的一種常規(guī)染色方法,但無法區(qū)別膠原纖維和肌肉。 N 粘液染色 (一)PAS染色法 與染糖元的方法相同。 (二)AB(pH2.5)染色法 1、試劑配制: 愛先藍(lán)8GX 1 g 蒸餾水 97 ml 冰醋酸 3 ml 核固紅液: 核固紅 0.1g 硫酸鋁 5g 麝香草酚 50mg 蒸餾水 97ml 2、染色步驟: (1)切片脫蠟至蒸餾水。 (2)愛先藍(lán)液染10~20分鐘 (3)蒸餾水洗 (4)核復(fù)染(核固紅5分鐘),水洗 (5)脫水,透明,封固。 唾液酸及弱硫酸化粘液及一般粘液呈藍(lán)色。常用于確定胞漿內(nèi)空泡的性質(zhì),特別是當(dāng)細(xì)胞呈現(xiàn)印戒樣特征時。 J 甲基綠派洛寧法(改良Cook,1974) 1、試劑配制: (1)2%甲基綠水溶液: 甲基綠(methyl green)1g 蒸餾水加至50ml 用三氯甲烷抽提,方法詳后。 (2)5%派洛寧水溶液: 派洛寧G(pyronine G)1g 蒸餾水加至20ml (3)0.2M醋酸鹽緩沖液(pH 4.8) 0.2M醋酸液41ml 0.2M醋酸鈉液59ml (4)甲基綠派洛寧染液: 2%甲基綠水溶液(經(jīng)抽提) 5ml 5%派洛寧水溶液 1ml 蒸餾水 12ml 0.2M醋酸鹽緩沖液(pH 4.8) 18ml 甲基綠水溶液的抽提:甲基綠為綠色粉末,屬三苯甲烷染料,這種染料是由氯代甲烷作用于結(jié)果晶紫而形成的一種化合物。由于甲基化作用,甲基綠就比甲基綠后,所引進(jìn)的甲基連接得并不牢固,容易從甲基綠中脫失。另一方面,在甲基化過程中,還有一部分結(jié)晶紫并沒有生成甲基綠,因此,也有人認(rèn)為甲中,常有少量的甲基紫或結(jié)晶紫成份。但是,也有人認(rèn)為甲基紫乃是甲基綠的衰敗產(chǎn)物,甲基綠在儲存過程中,會不斷產(chǎn)生甲基紫。因此,在配制試劑時,必須先將甲基綠所含的甲基紫或結(jié)晶紫抽提出來,才能使細(xì)胞核內(nèi)的脫氧核糖核酸染成綠色。抽提方法是取2%甲基綠水溶液20ml傾入潔凈分液漏斗,加入三氯甲烷20ml充分搖蕩混合,使其內(nèi)的甲基紫溶于三氯甲烷中而呈紫紅色。旋動分液漏斗下部的砂塞,慢慢把如此反復(fù)更換三氯甲烷,直到三氯甲烷無紫紅色為止,即可得到得純的甲基綠溶液。 2、操作步驟: (1)新鮮組織固定于Carnoy氏液(4℃)3~6小時,經(jīng)95%酒精和無水酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋。 (2)切片經(jīng)二甲苯脫蠟至蒸餾水。 (3)置入甲基綠派洛寧染液于室溫染30~60分鐘。 (4)取出切片,不經(jīng)水洗,用濾紙吸干多余染液。 (5)用丙酮迅速分化。 (6)轉(zhuǎn)入丙酮二甲苯(1:1)稍洗。 (7)二甲苯透明2~3次。 (8)中性樹膠封固。結(jié)果:存在于胞質(zhì)和核仁內(nèi)的核糖核酸呈紅紫色,胞核染色質(zhì)內(nèi)的脫氧核糖核酸綠色或綠藍(lán)色。 3、對照方法: (1)取另一連續(xù)切片用核糖核酸酶(rihonuclease)1mg/1ml于37℃溫箱內(nèi)消化3小時,蒸餾水洗后置入甲基綠派洛寧染液內(nèi)染色。 (2)切片在10%高氯酸(prechloric acid)于4℃處理12~18小時,水洗后用1%碳酸鈉液中和2分鐘,流水沖洗5分鐘,再用蒸餾水洗后置入甲基綠派洛寧染液內(nèi)染色。經(jīng)上述方法之一處理后的切片就為陰性。 4、注意事項(xiàng): (1)組織不宜用甲醛固定,應(yīng)選用Garnoy氏固定液,因?yàn)榫凭痛姿崮茌^好地保存核蛋白。 (2)Garnoy氏液固定標(biāo)本的時間不宜太長,超過一天則染色效果不理想。 (3)要注意試劑的質(zhì)量,特別是派洛寧,常常不同批號的染料,染色的效果不同。甲基綠和派洛寧二者的比例要恰當(dāng)。 (4)染色液的pH應(yīng)為4.8左右,如pH過低,甲基綠染色效果差;pH偏高,則派洛寧染色效果不良。 (5)丙酮分化時間要很好掌握,時間不宜太長。 (6)配妥的甲基綠派洛寧染液用后放冰箱保存,約可使用數(shù)周。 染色原理:對此法的染色原理,目前了解得還不夠清楚,一般可從下面兩方面理解。1、電離作用:脫氧核糖核酸和核糖核酸都有磷酸基,又有堿基,故為兩性電解質(zhì)。在一定的條件下,可以電離而帶電荷,因此都有一定的等電點(diǎn)。甲基綠和派洛寧在水中電離后,都產(chǎn)生帶陽電荷的離子。甲基綠電離后,在五價氮處產(chǎn)生二個正電荷,堿性較強(qiáng)。派洛寧電離后僅產(chǎn)生一個正電荷,堿性較甲基綠弱,在染色時二者進(jìn)行競爭,堿性較強(qiáng)的甲基綠就與胞核(等電點(diǎn)pH3.8~4.2)進(jìn)行極性吸著而結(jié)合,堿性較弱的派洛寧與胞質(zhì)(等電點(diǎn)pH4.6~5.2)吸附結(jié)合。2、聚合作用:甲基綠對聚合高的DNA有親和力,派洛寧對聚合低的RNA有親和力。因此,思慮在綠選染DNA,而派洛寧選染RNA。應(yīng)用:PNA主要存在于胞質(zhì)及核仁內(nèi),它主導(dǎo)細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成。在細(xì)胞增生,胞質(zhì)蛋白質(zhì)合成亢進(jìn)時,核仁和胞質(zhì)的PNA增加。因此,惡性瘤細(xì)胞核仁巨大,胞質(zhì)嗜堿。漿細(xì)胞和免疫母細(xì)胞胞質(zhì)合成免疫球蛋白,胰腺上皮合成胰蛋白酶。因此,這些細(xì)胞胞質(zhì)有很強(qiáng)的嗜堿性。胞質(zhì)嗜堿,是蛋白質(zhì)合成增強(qiáng)的標(biāo)志。 S 脂肪(蘇旦Ⅲ)法 1、試劑配制: 蘇旦Ⅲ 0.1~0.2 70% 酒精 100 ml 將蘇旦Ⅲ置于70%酒精中,加熱飽和,在未冷前過濾,靜置一夜。 2、染色步驟: (1)冰凍切片(8~10微米)。 (2)70%酒精固定1分鐘。 (3)放入蘇旦Ⅲ酒精溶液中20~30分鐘。 (4)70%酒精洗去多余的染料。 (5)水洗。 (6)蘇木素復(fù)染2~5分鐘。 (7)1%鹽酸酒精分化。 (8)水洗,藍(lán)化,甘油封固。 3、結(jié)果:脂肪桔黃或紅色。一般用于確定胞漿內(nèi)空泡究竟是糖原,水變性還是脂滴。 P 高碘酸-六胺銀-馬休黃染色法(PASM-M) 1、試劑配制: 六胺銀原液: 3 %六甲基四胺水溶液(烏洛托品) 20 毫升,5 %硝酸銀水溶液 10 毫升。 六胺銀工作液:六胺銀原液30毫升,雙蒸水 20毫升,5 %硼砂(四硼酸鈉)2毫升。 核固紅液:核固紅0.1 克,5 %硫酸鋁100毫升加熱溶解,貯存飽和液待用。 馬休黃液:馬體黃 0.5 克,無水酒精 98 毫升,磷酸 0.2 克。 2、操作方法: (1)常規(guī)脫蠟至水 (2)0.5%氧化20分鐘 (3)蒸餾水洗3次 (4)浸入六胺銀工作液中2小時左右(恒溫58℃) (5)蒸餾水洗3次 (6)0.2%氯化金1-2分鐘 (7)蒸餾水洗2次 (8)核固紅染色10-15分鐘 (9)馬休黃染色1分鐘 (10)放入溫箱烤干,二甲苯透明,中性樹膠封固 3、結(jié)果:腎小球毛細(xì)血管基膜呈黑色,背景和紅細(xì)胞呈黃色,細(xì)胞 核呈紅色。 4、注意: 1、六胺銀工作液現(xiàn)配現(xiàn)用,只能用一次。 2、第3步做完后可入5 %三氧化鉻(鉻酸)水溶液氧化40 分 鐘,再用1 %亞硫酸鈉除鉻,背景可能效果更佳。 3、馬休黃主要是染紅細(xì)胞。用無水酒精中脫水,黃色的背景就脫掉,可直接放入 溫箱或電吹風(fēng)吹干,封片。 R 瑞氏-姬姆薩染色方法 1、試劑配制: 原料:A:瑞氏染粉0.8--1克;吉姆薩染粉0.5克 B:甘油33ml C:甲醇500ml 配法:將A放入研缽中,加入少量B研磨,再加入少量B磨,再加入少量B磨……倒出,將未溶部分,繼續(xù)加入B磨……>全溶,加入C,或中間加入C 亦可。 2、染色步驟: 滴數(shù)滴入玻片蓋滿標(biāo)本,30秒,再加入雙蒸水或PBS2-3倍染1-3分中,傾去染液,水洗……封片。 T Trypan blue (臺盤蘭)排斥實(shí)驗(yàn): 細(xì)胞懸液0.1ml加入0.4% Trypan blue生理鹽水溶液0.1ml,混勻后滴在血球記數(shù)板上。存活率=不著色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)X100% TTC方法: TTC和活細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶反應(yīng),生成紅色的甲月贊,用來表示細(xì)胞的活力。配制多為2%,染色要避光,37度條件下,它是評價腦缺血損傷常用的指標(biāo)。 V Van Gieson法 1、試劑配制: 飽和苦味酸水溶液(約1.22%) 150 ml 1%酸性品紅 10 ml 兩種溶液用前混合在一起。 2、染色步驟: (1)切片脫蠟至蒸餾水。 (2)蘇木素深染。(10~15分鐘) (3)Van Gieson中染半分鐘。 (4)蒸餾水洗。 (5)置60℃溫箱中烘干。 (6)二甲苯透明,封固。 3、結(jié)果:膠原纖維紅色,肌纖維、胞漿、紅細(xì)胞黃色。 4、建議:用稀釋的Van Gieson液進(jìn)行染色,不用95%的酒精分化,結(jié)果色澤鮮艷,而且著色均勻。 |
|