估計(jì)這是大家用得最多的，所以先講這個(gè)了。
免疫組化技術(shù)現(xiàn)在是很成熟的方法，但是對(duì)免疫組化照片的分析并沒有一個(gè)權(quán)威的說法。現(xiàn)在可以查到無數(shù)篇應(yīng)用圖像分析來分析免疫組化的文獻(xiàn)，但幾乎沒有哪一篇能詳細(xì)地?cái)⑹龇治龅倪^程與方法。
首先，免疫組化的樣品應(yīng)該是用ＤＡＢ對(duì)免疫組化產(chǎn)物染色，同時(shí)用蘇木對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染。鏡下觀察樣品，細(xì)胞核被染上了藍(lán)色，胞漿間有黃色（強(qiáng)陽(yáng)性的地方會(huì)呈現(xiàn)棕黃色）。居然經(jīng)常能看到其他顏色的免疫組化照片，這肯定是樣品制作過程中有了差錯(cuò)。
用肉眼觀察免疫組化切片的結(jié)果只能是定性的，不準(zhǔn)確的。使用圖像分析軟件定量地（至少是半定量）對(duì)照片測(cè)量出一個(gè)數(shù)值來自然比用肉眼看更準(zhǔn)確。
切片上陽(yáng)性反應(yīng)物量是由圖片上黃色染色的深淺與面積一起表現(xiàn)的。所以最終要測(cè)量的就是圖片上黃色部分的累積光密度（IOD），這是個(gè)沒有單位的相對(duì)數(shù)值。就是把圖片上每個(gè)黃色的象素點(diǎn)的強(qiáng)度值全部累加起來得到的值。
IOD除以一個(gè)適當(dāng)?shù)拿娣e，就是一個(gè)平均光密度。這個(gè)面積可以就是照片的面積，也可以是照片上一個(gè)組織區(qū)域的面積，或者是有黃色的區(qū)域的面積。必須根據(jù)切片的實(shí)際情況來適當(dāng)選擇。
對(duì)于細(xì)胞核的免疫組化切片，在細(xì)胞核上，由于有藍(lán)色復(fù)染，所以需要另一種分析方法。將另作講解。
這張照片曝光稍大。但仍能表現(xiàn)出免疫組化的黃色染色與細(xì)胞核的藍(lán)染。
在拍攝照片時(shí)，需要注意的地方是：
１.所有的照片必須以同樣的顯微鏡環(huán)境與拍攝條件來拍攝。在拍攝照片時(shí)，要保持顯微鏡光源亮度的穩(wěn)定，用同樣的曝光時(shí)間拍攝照片。在更換視野或切片時(shí)，除了對(duì)焦距這個(gè)操作外，其他所有的操作都不能有變化。強(qiáng)陽(yáng)性的樣品就是暗的黃的，弱陽(yáng)性的樣品則亮一些，陰性樣品就是一片白。這樣才能測(cè)量出正確的密度值。
２.曝光的選擇：試拍攝一張空照片，看一下白色背景的亮度，應(yīng)該在２３０附近。過低過高都不好。
3.注意相機(jī)白平衡：如果使用的是專業(yè)CCD相機(jī)，會(huì)有校正白平衡的功能，此時(shí)應(yīng)對(duì)空視野進(jìn)行白平衡校正。如果是普通的數(shù)碼相機(jī)，要關(guān)閉自動(dòng)白平衡功能。或者選擇陽(yáng)光模式。避免拍攝的照片因?yàn)樯{(lán)或偏黃。
4.很多顯微鏡都是同時(shí)有熒光附件的，在拍攝熒光照片時(shí)要加上濾光片，注意有時(shí)候這些濾光片會(huì)忘了移開，結(jié)果拍攝的照片就會(huì)嚴(yán)重偏色。
正確地拍攝照片是圖像分析的基礎(chǔ)，以后的各項(xiàng)應(yīng)用實(shí)例中往往都會(huì)先介紹如何拍攝照片。
圖像分析方法：
1.校正圖片光密度
分析免疫組化照片，第一步就是要校正光密度。照片上黃色點(diǎn)的亮度數(shù)值是灰度，黑色為0，白色為255.這與免疫組化強(qiáng)度是相反的。深色深的點(diǎn)，數(shù)值應(yīng)該更大才對(duì)。在理論上，圖片上的灰度與樣品阻擋光線的物質(zhì)光密度是一個(gè)指數(shù)關(guān)系，對(duì)于白色的色點(diǎn)，對(duì)應(yīng)樣品透光率為100%，光密度為零。對(duì)于黑色的點(diǎn)，對(duì)應(yīng)樣品透光率為0，光密度為無窮大，但實(shí)際上把這個(gè)光密度值定為2.0.校正光密度值就是把程序的光密度值設(shè)置成這樣的坐標(biāo)。
在carliberation intensity的窗口里點(diǎn)new,然后選擇std option density.
把鼠標(biāo)放在圖片上最白的地方，然后看程序窗口下方的狀態(tài)欄，會(huì)有顯示該點(diǎn)的三色各自的灰度值，在其顯示的數(shù)值中間選擇一個(gè)差不多的整數(shù)，比如230，或220，作為背景扣除值。操作方法是：點(diǎn)option按紐，在彈出的小窗口中的incident level中把默認(rèn)的255改為230或220.返回就可以了。
最后在窗口右上方點(diǎn)一下system把這個(gè)校正作為系統(tǒng)光密度值應(yīng)用于所有圖片。這個(gè)設(shè)定被默認(rèn)地命名為intensity cal 0 。光密度校正的窗口不要關(guān)閉，可以移到邊上放著隨時(shí)檢查。有時(shí)候新照片未必會(huì)應(yīng)用上，要重新調(diào)出剛才設(shè)定的intensity cal 0.
2.選色。
在segmentation中使用HSI模式，選擇H:0-30,S:0-255,I:0-230.然后點(diǎn)file -- save。HSI的選擇范圍是可以根據(jù)圖片情況作微調(diào)的。保存這個(gè)選色設(shè)置。一般放在圖片的保存文件夾里。默認(rèn)的保存文件是rgb24.rge。
3.設(shè)置分析環(huán)境。
一個(gè)是select measurement。要選擇IOD。另外默認(rèn)的選擇area都是要測(cè)量的。對(duì)area的過濾值，默認(rèn)為10，實(shí)際上還可以大點(diǎn)，設(shè)置到25甚至50也行，可以把那些小的雜質(zhì)點(diǎn)去掉。
另一個(gè)是option:
outline :filled
label style :none
dark background on sample :no
smoothing=1
filled hole:on
clean border : none
4.保存分析環(huán)境。
在count/size窗口中點(diǎn)file save settings。保存環(huán)境設(shè)置文件。
5測(cè)量
用irregular工具畫出測(cè)量區(qū)域。
這里很關(guān)鍵的一點(diǎn)就是如何畫這個(gè)測(cè)量區(qū)域。
最普通的情況下，要測(cè)量整張照片的光密度，就不必畫這個(gè)測(cè)量區(qū)域了。此時(shí)會(huì)測(cè)量照片上全部被選中的黃色的光密度總和（IOD SUM），面積就是照片的面積。
如果你拍攝的照片上，有個(gè)角正處于切片邊緣，沒有細(xì)胞，這就需要把這個(gè)角上的空白面積給扣掉了，此時(shí)畫的“測(cè)量區(qū)域”就應(yīng)該沿著樣品的邊緣來畫。
另一種情況是，要測(cè)量一個(gè)癌巢里的蛋白表達(dá)，邊上正常組織上的表達(dá)不算。這時(shí)候就要沿著這個(gè)癌巢的邊界畫這個(gè)“測(cè)量區(qū)域”。
點(diǎn)count按紐。完事。測(cè)量數(shù)據(jù)在view statistics窗口中，讀取IOD SUM數(shù)值，作為這張照片的累積光密度值。其他的數(shù)值都是沒用的。
如果你用irregular工具畫了一個(gè)“測(cè)量區(qū)域”，那點(diǎn)count時(shí)，程序會(huì)只測(cè)量“測(cè)量區(qū)域”內(nèi)的IOD。外面的不管。
在測(cè)量數(shù)據(jù)中顯示的area是黃色部分的面積。在很多情況下，這個(gè)面積值意義不大。
6.測(cè)量面積。
通常我們需要測(cè)量的是一個(gè)平均光密度（mean density）而不是積分光密度(IOD)。上一步已經(jīng)測(cè)量了IOD，現(xiàn)在就要測(cè)量area了，再說一遍，上一步的測(cè)量數(shù)據(jù)里的area在通常情況下并不是正確的area。
如果測(cè)量的是整張照片，area就是照片的面積。如果用irregular畫了“測(cè)量區(qū)域”，area就是這個(gè)測(cè)量區(qū)域的面積。此時(shí)只要在count/size窗口中點(diǎn)edit - convert AOI to object，然后就能在測(cè)量數(shù)據(jù)窗口中看到測(cè)量面積了。此時(shí)還能看到另一個(gè)IOD值，這個(gè)值是不能用的，它包括了藍(lán)色細(xì)胞核的光密度。
7.數(shù)值處理：
對(duì)每一張照片，要測(cè)量一個(gè)IOD SUM ，如果選擇了測(cè)量區(qū)域，還要測(cè)量一個(gè)area。
這張照片的測(cè)量值一般是平均光密度，它反映了這張照片上免疫反應(yīng)物的表達(dá)強(qiáng)度。
mean density = (IOD SUM) / area
在測(cè)量整張照片的時(shí)候，可以只測(cè)量IOD SUM ，在這種情況下，所有照片的面積都是相等的。
mean density 與 IOD 都是個(gè)相對(duì)值，所以是沒有單位的。其實(shí)OD值本身就是個(gè)比例值。這個(gè)詞在分光光度計(jì)上常用，意思是optical density
通常我們有兩組實(shí)驗(yàn)對(duì)象，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，每組有十來個(gè)樣品，各拍攝幾張照片。
每個(gè)樣品拍攝的幾張照片測(cè)量的mean density再作一次平均，作為這個(gè)樣品的mean density.
一個(gè)實(shí)驗(yàn)組的幾個(gè)樣品測(cè)量值可以計(jì)算其平均值與標(biāo)準(zhǔn)差，或者直接用T檢驗(yàn)去統(tǒng)計(jì)兩組的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
把一張照片的測(cè)量值當(dāng)作一個(gè)數(shù)據(jù)也是可以的。
再次強(qiáng)調(diào)，一張照片只測(cè)量一個(gè)IOD值或mean density值，作為這張照片的測(cè)量數(shù)據(jù)。statistics窗口中的其他統(tǒng)計(jì)數(shù)值不必管它。
8.批量測(cè)量照片：
測(cè)量一組照片時(shí)，首先用一張比較典型的照片按上面步驟測(cè)量。然后在測(cè)量其他照片時(shí)，必須用這些測(cè)量條件來測(cè)量。因?yàn)橐呀?jīng)保存了背景校正、選色文件與測(cè)量環(huán)境文件，所以在測(cè)量時(shí)要直接調(diào)用這些設(shè)置文件。
8.1 把第一張照片最小化，不要關(guān)閉。
8.2 打開第二張照片，或者一次打開全部照片，激活一張。
8.3 檢查光密度校正窗口，確認(rèn)應(yīng)用了光密度校正。
8.4 在count/size中l(wèi)oad settings，調(diào)出環(huán)境設(shè)置文件。
8.5 點(diǎn)select color 調(diào)出segmentation窗口。確認(rèn)處于Histograph及HSI模式下。再調(diào)出選色文件。
8.6 需要時(shí)用irregular畫測(cè)量區(qū)域。
8.7 點(diǎn)count 測(cè)量IOD，記錄數(shù)據(jù)（點(diǎn)statistics中的DDE to excel），再點(diǎn) convert AOI to object 測(cè)量面積，再記錄數(shù)據(jù)（還是點(diǎn)statistics 里的DDE to Excel，注意，這是兩次向excel輸送數(shù)據(jù)，所以事先要在DDE option中選擇append data to end，否則后面的數(shù)據(jù)會(huì)沖掉前面的）。
8.8 關(guān)閉圖片，再測(cè)量下一張。
9.上面的測(cè)量步驟有個(gè)系統(tǒng)誤差。在測(cè)量IOD的時(shí)候是直接測(cè)量彩色照片的IOD，雖然對(duì)測(cè)量結(jié)果影響不大，如果希望測(cè)量得細(xì)致一點(diǎn)，就需要增加一個(gè)將彩色圖片轉(zhuǎn)換成黑白圖片的步驟。方法是：
在選擇完顏色后（就是上面的8.5之后），在segmentation窗口里的view下面選擇transparant on white.可以看見圖片上除了黃色外，其他地方都變成白色了。
然后點(diǎn) create preview image復(fù)制這張效果圖片。
轉(zhuǎn)換這張圖片為8位灰度格式（grey scale 8）。
在這張灰度圖片上用irregular畫測(cè)量區(qū)域（就是按照上面的8.6以后繼續(xù)作）。
對(duì)灰度圖片還要再作一次選色，此時(shí)select color 按紐會(huì)變成 select ranges，只有一個(gè) I 可以選擇，此時(shí)選擇范圍是0-240 。
這回的IOD測(cè)量值與稍大一點(diǎn)。這是正確的光密度測(cè)量值。但操作上增加了很多步驟。也不便于編制宏操作進(jìn)行測(cè)量。
10.下面是一個(gè)關(guān)于免疫組化照片分析原理與方法的講座PPT。
還有一個(gè)屏幕錄像演示。
http://cid-9694254737a6cc5e.skydrive./browse.aspx/ipp%20flash
